Summary
Tradicionalmente a fatia vertical e toda a preparação para montagem da retina têm sido usados para estudar a função dos circuitos da retina. Aqui, descrevemos a novela corte método para preservar a morfologia dendrítica de neurônios da retina intacta.
Abstract
Tradicionalmente a fatia vertical e toda a preparação para montagem da retina têm sido usados para estudar a função dos circuitos da retina. No entanto, muitos dos neurônios da retina, tais como as células amácrinas, expandir as suas dendrites horizontalmente, de modo que a morfologia das células é suposto ser severamente danificado nas fatias verticais. Em toda a preparação de montagem, especialmente para patch-clamp gravações, os neurônios da retina na camada do meio não são facilmente acessíveis devido à extensa cobertura de células gliais endfeets (célula Mueller) s. Aqui, descrevemos a novela corte método para preservar a morfologia dendrítica de neurônios da retina intacta. A fatia foi feito horizontalmente na camada interna da retina usando um cortador de vibratome após a retina foi incorporado na baixa temperatura de fusão agarose gel. Nessa preparação fatia horizontal da retina, estudamos a função dos neurônios da retina comparado com sua morfologia, usando patch-clamp gravação, técnica de imageamento de cálcio, imunocitoquímica, e de uma única célula RT-PCR.
Protocol
Discussion
Existem várias vantagens importantes da preparação fatia horizontal da retina.
Primeiro, a morfologia das células que se expandem horizontalmente dendrites, como as células amácrinas e células horizontal, é preservada. Tem sido demonstrado que há mais de 20 tipos de células amácrinas na retina (MacNeil e Masland, 1998), de modo que é muito importante para comparar a morfologia das células com a propriedade fisiológica.
Em segundo lugar, em toda a retina de montagem, a extensa cobertura do endfeets células glia…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a drs. Richard H. Masland e Akimichi Kaneko por nos dar conselhos e sugestões valiosas para estabelecer o procedimento da preparação fatia horizontal da retina.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agar | Sigma | A-1296 | ||
| Agarose L | Wako | 317-01182 | Low-temperature melting agarose | |
| Hyaluronidase | Sigma | Type I-S, 300 units/mg | ||
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | |||
| Microwave | ||||
| Hot water bath | 35 C | |||
| Vibratome slicer | Leica | VT1000S | ||
| MF-Membrane filters | Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 um | |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | |||
| Instant glue | eg., Alonalpha, Krazy Glu | |||
| 50 ml syringe | ||||
| syringe filter | Millipore | SX0001300 |
Riferimenti
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A., Koizumi, A., TC, J. a. k. o. b. s., Masland, R. H., MA, M. a. c. N. e. i. l., RH, M. a. s. l. a. n. d. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
