Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Sommario

Qui mostriamo microiniezione citoplasmatica di Xenopus laevis Ovociti con un substrato di importazione nucleare, così come la preparazione degli ovociti iniettati per la visualizzazione da parte sottile sezionamento microscopia elettronica.

Abstract

Microiniezione degli ovociti di Xenopus laevis seguita da sottile sezionamento microscopia elettronica (EM) è un sistema eccellente per studiare il trasporto nucleocytoplasmic. A causa del suo nucleo di grandi dimensioni e ad alta densità di complessi poro nucleare (NPC), il trasporto nucleare può essere facilmente visibili nel ovociti di Xenopus. Di conoscere molto dei meccanismi di importazione ed esportazione nucleare è stata acquisita attraverso l'utilizzo di questo sistema (recensito da Pante, 2006). Inoltre, abbiamo utilizzato microiniezione degli ovociti di Xenopus di sezionare le vie importazione nucleare di diversi virus che si replicano nel nucleo ospitante.

Qui mostriamo la microiniezione citoplasmatica degli ovociti di Xenopus con un substrato importazione nucleare. Mostriamo anche la preparazione degli ovociti iniettati per la visualizzazione da parte sottile sezionamento EM, tra cui la dissezione, disidratazione e inclusione degli ovociti in una resina epossidica embedding. Infine, mettiamo a disposizione dei risultati rappresentativi per ovociti che sono stati microiniettati con il capside del nucleopolyhedrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) o il virus Minuto parvovirus del Mouse (MVM), e discutere le potenziali applicazioni di questa tecnica.

Protocollo

Parte 1: Preparazione di ovociti di Xenopus per microiniezione

1. Posizionare un piccolo pezzo (circa 2 cm) di ovaio Xenopus laevis in una da 50 ml tubo conico che contiene 20 ml di soluzione di collagenasi (5 mg / ml di collagenasi di calcio senza modifica di Barth salina: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO _4, 10 Hepes mM, pH 7,5). Collagenasi viene utilizzata per rimuovere le cellule del follicolo che circondano gli ovociti.
2. Posizionare il tubo su una piattaforma shaker e rock delicatamente (a 100 RPM) per un'ora. Questa volta varia con diversi lotti di collagenasi. Così dopo un'ora, prendere un piccolo campion....

Discussione

Microiniezione degli ovociti di Xenopus combinato con sottili sezionamento EM è uno strumento altamente efficace per studiare il trasporto nucleocytoplasmic. Questo sistema è stato utilizzato per mappare fasi distinte di importazione attraverso la NPC, per esempio l'interazione di un substrato di importazione nucleare con componenti strutturali della NPC, come i filamenti citoplasmatici e basket nucleare (recensito da Pante, 2006). E 'stato anche utilizzato per studiare il nucleare di importazione nucle.......