איסוף cryopreservation של ביציות ועוברים אוגר עכבר
Summary
במאמר וידאו זה אנו מציגים הפגנה צעד אחר צעד כיצד לאסוף ביציות cryopreserve אוגר עם שלאחר ההפשרה שיעור גבוה הישרדות. ההליך אותו יכול גם להיות מיושם בהצלחה להקפיא להפשיר עוברי עכבר בשלבים שונים של פיתוח preimplantation.
Abstract
עוברים וביציות היו הראשונים cryopreserved בהצלחה יותר מ -30 שנים, כאשר Whittingham<i> Et al.</i><sup> 1</sup> ו וילמוט<sup> 2</sup> תיאר בנפרד כי עוברי עכבר יכול להיות קפוא המאוחסן -196 מעלות צלזיוס, כמה שנים מאוחר יותר, Parkening<i> ואח'</i>.<sup> 3</sup> דיווח על לידת צאצאים חיים הנובע הפריה חוץ גופית (IVF) של ביציות cryopreserved. מאז, השימוש בטכניקות cryopreservation התפשט במהירות להיות מרכיב חיוני בפועל של שעתוק בסיוע אדם ובעלי חיים ועל שימור משאבי גנטית של חיות. נכון לעכשיו, יש שתי שיטות עיקריות משמש cryopreserve ביציות ועוברים: הקפאת vitrification איטי. מגוון רחב של גישות שימשו כדי לנסות לשפר הן טכניקות של מיליוני בעלי חיים אלפי ילדים נולדו מעוברים cryopreserved. עם זאת, חסרונות חשובים הקשורים ל cryopreservation עדיין צריך להתגבר, מאז היווצרות קרח קריסטל, אפקטים פתרון הלם אוסמוטי נראה לגרום cryoinjuries מספר שלאחר להפשיר ביציות ועוברים. הקפאה איטית עם מקפיאים לתכנות יש את היתרון של שימוש בריכוזים נמוכים של cryoprotectants, אשר מזוהה בדרך כלל עם רעילות כימית הלם אוסמוטי, אבל היכולת שלהם למנוע היווצרות קרח קריסטל בריכוזים נמוכים היא מוגבלת. הקפאה איטית גם גורם תופעות קירור כי יש להימנע באמצעות זריעה ידנית או אוטומטית<sup> 4</sup>. בתהליך vitrification, ריכוזים גבוהים של cryoprotectants לדכא היווצרות של גבישי קרח ו להוביל להיווצרות של מדינה מזוגגת glasslike שבו המים הקרושה, אך לא הרחיב. עם זאת, בשל רעילות של cyroprotectants על ריכוזי בשימוש, ביציות / עוברים רק יכול להיחשף לפתרון cryoprotectant לתקופה קצרה מאוד של זמן בפתרון נפח המינימום, לפני השריית דגימות ישירות חנקן נוזלי<sup> 5</sup>. בעשור האחרון, vitrification הפך פופולרי יותר כי היא שיטה מהירה מאוד שבו לא ציוד יקר (במקפיא לתכנות) נדרשת. עם זאת, הקפאה איטית ממשיכה להיות השיטה הנפוצה ביותר עבור cryopreservation הביצית / העובר. במאמר וידאו זה אנו מראים, צעד אחר צעד, איך לאסוף לאט להקפיא ביציות אוגר עם שלאחר ההפשרה שיעור גבוה הישרדות. ההליך אותו יכול גם להיות מיושם בהצלחה להקפיא להפשיר עוברי עכבר בשלבים שונים של פיתוח preimplantation.
Protocol
Discussion
עם ביציות זה אוגר פרוטוקול עוברי עכבר ניתן cryopreserved בהצלחה. קפוא פעם, ביציות / עוברים ניתן לאחסן מכלי חנקן נוזלי ללא הגבלת זמן והחלים בכל זמן או מקום הרצוי. זו מציעה את היתרון שיש דגימות כמעט מוכנה להשתמש בכל פעם לפי הצורך. מצד שני, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לייצר cryobanks העובר מן הז…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Ministerio ספרדית דה Educación y Ciencia (BIO 2006-11792) ואת Generalitat דה קטלוניה (2005-SGR00437). המחברים מבקשים להודות מארק Puigcerver ואת יונתן לוקאס לקבלת סיוע טכני שלהם בהכנת התקשורת. כל הצוות של ד 'Servei Estabulari הוא הודה לדיור בעלי חיים, ובעיקר חואן חוסה מרטין חבייר בניטו על תרומה נוספת על הקלטה של וידאו חלק זה. NCB הוא עמית של Fundação פורטוגזית פסקה דואר Ciência Tecnologia ו SG הוא עמית של הספרדי Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
Riferimenti
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
