İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar
Summary
Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Zebra balığı uzun zaman atlamalı görüntüleme ile yaşayan şeffaf embriyonun gelişim hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Burada uzun vadeli görüntüleme için zebrafish embriyolar montaj ve konfokal bir mikroskop kullanılarak zaman atlamalı görüntüleri yakalama otomatikleştirmek için nasıl göstermek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz de iki foton mikroskop üzerine monte edilmiş bir femtosaniye lazer odaklı güç kullanarak zebrafish periferik duyusal aksonlar bireysel şube kontrollü, kesin hasar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Başarılı iki foton axotomy için parametreler her mikroskop için optimize edilmiş olmalıdır. Biz iki örnek sağlamak için özel inşa edilen iki foton mikroskop ve Zeiss 510 konfokal / iki-foton hem de iki foton axotomy gösterecektir.
Zebra balığı trigeminal duyusal nöronlar bir duyusal nöron spesifik 1 organizatörü tarafından yönlendirilen bir transgenik hattı ifade GFP görüntülenebilir. Biz doğrudan doğruya zebrafish embriyolar yaşayan duyusal akson rejenerasyonu gözlemlemek için bu zebrafish trigeminal model adapte var. Embriyolar tricaine ile anestezi ve agaroz bir damla içinde katılaşır olarak konumlandırılmış. İmmobilize embriyolar phenylthiourea (PTU) Zil sesleri ile dolu bir görüntüleme odası içinde mühürlenir. Embriyoların 12-48 saat boyunca sürekli bu odaları görüntülü olduğunu bulduk. Sonra tek bir konfokal görüntü axotomy istenen site belirlemek için yakalanır. Ilgi bölge görüntüleme, düşük, zararlı olmayan güç altında duyusal aksonlar tarafından iki foton mikroskop yer almaktadır. Axotomy istenen sitesinde yakınlaştırma sonra, gücü artar ve tanımlanan bölgenin tek bir tarama akson koparmaya yeterli olur. Çoklu konumu zaman atlamalı görüntüleme sonra yaralanma aksonal kurtarma doğrudan gözlemlemek için bir konfokal mikroskop kurulur.
Protocol
Discussion
Biz tam periferik duyusal aksonlar axotomize ve oturma zebrafish embriyo rejenerasyon doğrudan gözlemlemek için açıklanan yöntemleri kullanmışlardır. Zebrafish Uzun vadeli zaman atlamalı konfokal görüntüleme in vivo birçok gelişimsel süreçlerini gözlemlemek için kullanılabilir. Açıklanan iki foton axotomy prosedürü, pek çok farklı deneysel amaçları için değiştirilebilir. Biz hücre gövdesi ziyade periferik akson bir şube yakınlaştırma, tüm trigeminal duyusal nöron hücre g?…
Acknowledgements
Biz zaman atlamalı görüntüleme için montaj tavsiye lokal doku hasarı, Kathy Joubin ve tartışmalar için Sagasti ve Portera-Cailliau laboratuvarları oluşturmak için bir iki foton mikroskop kullanarak ilk tavsiye Mark Terasaki teşekkür ederim. İlk deneyler, AS, MA Woods Hole Deniz Biyolojik Laboratuarlarında Çim Vakfı Üyesi olarak yapıldı. Whitehall Vakfı, Klingenstein Vakfı ve Biyolojik Bilimler Burroughs Wellcome Fonu Kariyer Ödülü hibe Sagasti laboratuarında çalışmalar desteklendi.
Riferimenti
- Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15, 804-814 (2005).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Sacconi, L. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Yanik, M. F. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822-822 (2004).
- Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. Mechanisms of laser cellular microsurgery. Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).
