Herstellung von Myogenic Engineered Tissue Konstrukte
Summary
Hier zeigen wir die Herstellung von Kollagen-basierten, baut Gewebe mit Skelettmyoblasten. Diese 3-D konstruiert Konstrukte verwendet zu ersetzen oder zu reparieren Gewebe werden<em> In vivo</em>. Für unsere Zwecke haben wir diese als AV-elektrische Leitung für die Reparatur von kompletten AV-Block entwickelt<sup> [1]</sup>.
Abstract
Trotz der Tatsache, dass die elektronische Herzschrittmacher sind lebensrettende medizinische Geräte, deren langfristige Performance bei pädiatrischen Patienten kann problematisch wegen der Einschränkungen durch ein Kind seiner geringen Größe und ihrer unvermeidlichen Wachstum auferlegt werden. Folglich gibt es einen echten Bedarf an innovativen Therapien speziell für pädiatrische Patienten mit Herzrhythmusstörungen entwickelt. Wir schlagen vor, dass eine leitende biologische Alternative, bestehend aus einer Kollagen-basierten Matrix mit autologen-abgeleiteten Zellen könnte besser zum Wachstum anzupassen, reduzieren die Notwendigkeit für wiederkehrende Operationen, und verbessern Sie die Qualität des Lebens für diese Patienten. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Verfahren zur Einbindung primären Skelett Myoblasten Zellkulturen in einem Hydrogel-Matrix der Mode eine chirurgisch-implantierbaren Gewebe zu konstruieren, das als elektrische Leitung zwischen dem oberen und unteren Kammern des Herzens dienen. Letztlich erwarten wir mit dieser Art von gezüchteten Gewebe zu atrioventrikulären elektrische Leitfähigkeit bei Kindern mit komplettem Herzblock wiederherzustellen. In Anbetracht dieser, isolieren wir Myoblasten aus der Skelettmuskulatur von neonatalen Lewis Ratten und Platte sie auf Laminin-beschichtete Gewebe Kulturschalen mit einer modifizierten Version des etablierten Protokollen<sup> [2, 3]</sup>. Nach 1-2 Tagen werden kultivierten Zellen gesammelt und mit Antibiotika versetzt, Typ-1-Kollagen, Matrigel ™ und NaHCO<sub> 3</sub>. Das Ergebnis ist eine zähflüssige, einheitliche Lösung, die in eine Form von nahezu beliebiger Größe und Form gegossen werden kann<sup> [1, 4, 5]</sup>. Für unsere Gewebe Konstrukte beschäftigen wir Typ-1-Kollagen aus fetalen Lamm Haut unter Verwendung von Standardverfahren isoliert<sup> [6]</sup>. Sobald das Gewebe bei 37 ° C verfestigt, Kulturmedien ist sorgfältig auf die Platte gegeben, bis das Konstrukt ist untergetaucht. Die gezüchteten Gewebe wird dann weiter zu verdichten durch Dehydratisierung für 2 weitere Tage erlaubt, an welcher Stelle es reif ist<em> In-vitro-</em> Beurteilung oder chirurgische Implantation.
Protocol
Discussion
Die Formen, in denen das Gewebe konstruieren gegossen werden kann in jeder Form und Größe hergestellt werden, allerdings muss es mindestens zwei Befestigungspunkte werden. Ansonsten bilden die Matrix und Zellen eine kugelförmige Struktur und die Zellen sterben. In der vorliegenden Protokoll, beschreiben wir die Verwendung eines Polyester-Mesh für diesen Zweck, aber wir haben auch erfolgreich Edelstahlgewebe verwendet. Offensichtlich werden größere Formen erfordern mehr Zellen und ein größeres Volumen der sonstig…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
, Ein New Researcher Award vom Thrasher Research Fund, und Beiträge an die Reizleitung Fund an der Kinderklinik Boston; Diese Arbeit wird durch Forschungsmittel von den National Institutes of Health (HL088206 HL068915) unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Silicone tubing | VWR | 60985-724 | ||
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | ||
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | ||
| Laminin | Sigma | L2020 | ||
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma | N6908 | ||
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | ||
| Dispase-2 | Roche | 10295825001 | ||
| Collagenase 2 | Worthington | 46H8863 | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G5071 | ||
| 150 mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353025 | ||
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | ||
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | ||
| 7.5% NaHCO3 | Gibco | 25080-094 | ||
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | ||
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | ||
| 50 mL Conical Vial | BD Falcon | 352098 | ||
| 15 mL Conical Vial | BD Falcon | 352099 | ||
| 0.2 μm filter | Nalgene | 194-2520 |
Riferimenti
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
