Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts
Summary
Dit artikel beschrijft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie techniek om optisch image actie potentiaal beweging op het oppervlak van de Langendorff-geperfuseerde rattenharten met behulp van een potentiometrische kleurstof (di-8-ANEPPS).
Abstract
Optische kaart brengen van de cardiale oppervlak met voltage-gevoelige fluorescente kleurstoffen is uitgegroeid tot een belangrijk instrument om elektrische excitatie te onderzoeken in experimentele modellen die variëren in schaal van cel culturen om hele organen<sup> [1, 2]</sup>. Met behulp van state-of-the-art optische beeldvorming systemen, genereren en verspreiden van actiepotentialen tijdens normale hartritme of het hele initiëren en onderhouden van aritmieën kunnen worden gevisualiseerd vrijwel direct<sup> [1]</sup>. De meest recente in de handel verkrijgbare systemen kunnen informatie geven op zeer hoge resoluties en spatiotemporele waren gebaseerd op custom-built apparatuur in eerste instantie ontwikkeld om de obstakels worden opgelegd door de meer conventionele methoden te overwinnen elektrofysiologische<sup> [1]</sup>. Ontwikkelingen in hoge resolutie en hoge snelheid Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) camera's en intens-felle, light-emitting diodes (LED's) als voltage-gevoelige kleurstoffen, optica, en filters zijn begonnen met het elektrisch signaal overname te maken praktisch voor hart-en celbiologen die meer gewend om te werken met microscopen. Hoewel de nieuwste generatie van CMOS-camera's kunnen verwerven 10.000 frames per seconde op een 16.384 pixel array, afhankelijk van het type van monstervoorbereiding, reeds lang bestaande fluorescentie overname technologieën zoals fotodiode arrays, laser scanning systemen, en gekoelde charged-coupled device (CCD ) camera's hebben nog een aantal duidelijke voordelen met betrekking tot dynamisch bereik, signaal-ruisverhouding, en quantum efficiency<sup> [1, 3]</sup>. In de huidige studie werden Lewis rattenharten geperfuseerde<em> Ex vivo</em> Met een kristalloïde perfusaat (Krebs-Henseleit-oplossing) bij 37 ° C op een aangepaste Langendorff apparaat. Na een 20 minuten stabilisatieperiode, werden de harten met tussenpozen geperfuseerd met 11 mmol / l 2,3-butaandion monoxime om krimp-geassocieerde bewegingen te elimineren tijdens de afbeelding overname. Voor optische mapping, we geladen harten met de snelle respons potentiometrische probe di-8-ANEPPS<sup> [4]</sup> (5 mmol / L) en in het kort verlicht het preparaat, met 475 ± 15 nm excitatie licht. Tijdens een typische twee seconden periode van verlichting, was> 605 nm uitgestraalde licht van de cardiale voorbereiding afgebeeld met een high-speed CMOS-camera is aangesloten op een horizontale macroscoop. Voor deze demonstratie, harten werden tempo op 300 slagen per minuut met een coaxiale elektrode is aangesloten op een geïsoleerde elektrische stimulatie eenheid. Gelijktijdig bipolaire elektrografische opnames werden verworven en geanalyseerd, samen met de spanning signalen met behulp van gemakkelijk verkrijgbare software. Op deze manier kan actiepotentialen op het oppervlak van Langendorff-geperfuseerde rattenharten worden gevisualiseerd en geregistreerd bij elektrografisch signalen.
Protocol
Discussion
Wegnemen van het hart van de verdoofde ratten snel moeten worden uitgevoerd om myocardischemie te voorkomen. Als ischemie of onvoldoende coronaire perfusie optreedt, zal het hart waarschijnlijk ontwikkelen aritmieën en kan worden infarct. Daarnaast zullen deze harten tonen onvoldoende fluorescentie-emissie voor informatieve opnames en de daarop volgende analyses. Voor het laden van de kleurstof, myocardcellen moeten adequaat worden geperfuseerd met Krebs-Henseleit oplossing om vast te stellen en onderhouden van een fys…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door subsidies voor onderzoek van de National Institutes of Health (HL068915, HL088206) en bijdragen aan het hartgeleiding Fonds op Children's Hospital Boston.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock, Rochester, NY 14624 USA | FF505-SDi01-25×36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix Inc., Beaverton, OR 97005 USA | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma, St. Louis, MO 63132 USA | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc., Lake Forest, IL 60045 USA | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd Inc., Iowa 51601 USA | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma, St. Louis, MO 63132 USA | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA | D-3167 |
Riferimenti
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
