Imagerie en temps réel du noyau dense de vésicules cultures primaires neurones de l'hippocampe
Summary
Imagerie des cellules vivantes est d'une utilité particulière lorsque l'on étudie la dynamique du trafic des organelles. Nous décrivons ici un protocole d'imagerie en temps réel du noyau dense vésicules dans des neurones cultivés en utilisant la microscopie à fluorescence à champ large. Ce protocole est flexible et peut être adaptée aux organites autre image tels que les mitochondries, les endosomes, et les peroxysomes.
Abstract
L'observation et la caractérisation dynamique des processus cellulaires peuvent donner des informations importantes sur l'activité cellulaire qui ne peut pas être acquise à partir d'images statiques. Vital sondes fluorescentes, en particulier la protéine fluorescente verte (GFP) ont révolutionné la biologie cellulaire provenant de la capacité d'étiquette spécifique compartiments intracellulaires et des structures cellulaires. Par exemple, l'imagerie en temps réel de la GFP (et ses variantes spectrale) chimères ont permis une analyse dynamique du cytosquelette, le transport des organites, et la dynamique des membranes dans une multitude d'organismes et de types cellulaires [1-3]. Bien que l'imagerie vivons est devenue prédominante, cette approche pose encore de nombreux défis techniques, en particulier dans les neurones primaires en culture. Une des difficultés est l'expression de la GFP dans les protéines étiquetées neurones post-mitotiques, l'autre est la capacité à capturer des images fluorescentes tout en minimisant la phototoxicité, photoblanchiment, et maintenir la santé cellulaire en général. Ici nous fournissons un protocole qui décrit une méthode de transfection à base de lipides qui donne un taux de transfection est relativement faible (~ 0,5%), est cependant idéal pour l'imagerie des neurones complètement polarisée. Un taux faible de transfection est essentielle pour que les axones et des dendrites seule peut être caractérisée comme à leur orientation vers le corps cellulaire pour confirmer la directionnalité du transport, c'est à dire, antérograde c. rétrograde. Notre approche à l'imagerie neurones exprimant la GFP s'appuie sur une norme large champ microscope à fluorescence équipé d'une caméra CCD, un logiciel de capture d'image, et une chambre chauffée imagerie. Nous avons imagé une grande variété d'organites ou structures, par exemple, à noyau dense de vésicules, les mitochondries des cônes de croissance, et l'actine sans optiques ou exigences particulières d'excitation autre qu'une source de lumière fluorescente. De plus, le spectre est distincte, les protéines marquées par fluorescence, par exemple, la GFP et DsRed-protéines étiquetées, peuvent être visualisées simultanément près de caractériser la co-transport ou autres coordonnées événements cellulaires. L'approche d'imagerie décrit ici est flexible pour une variété d'applications d'imagerie et peut être adopté par un laboratoire pour un coût relativement peu fourni un microscope est disponible.
Protocol
Discussion
Imagerie des cellules vivantes est une technique difficile, mais puissant pour l'observation directe des transports en organite neurones en culture. Des difficultés peuvent survenir en amont de la procédure avec la santé des neurones pauvres à cause de complications de la culture. Par conséquent, la santé des cellules (pour des exemples voir réf. 4) devrait être évaluée avant et après la transfection par l'observation des lamelles alors que dans un milieu de croissance à l'aide d'un microscop…
Acknowledgements
Nous remercions Harald Hutter et Hélène Decker pour leur lecture attentive de ce manuscrit. Nous remercions également Reg Sidhu de Leica Microsystems pour son expertise technique. Cette recherche a été soutenue par les sciences naturelles et en génie du Canada, le Prix # 327100-06, et l'Université Simon Fraser Faculté des sciences.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | Gibco/Invitrogen | 15630-130 | Live-imaging medium |
Riferimenti
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
