Isolatie van Protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis thaliana</em
Summary
Deze video toont een procedure voor het isoleren van intacte protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis. Gezien het feit dat de geïsoleerde protoplasten intact blijven gedurende minstens 96 uur en worden geïsoleerd van zaailingen in plaats van een-maand-oude volwassen planten, deze procedure versnelt assays die intact protoplasten.
Abstract
Protoplasten zijn plantaardige cellen die hebben hun celwanden enzymatisch verwijderd. Isolatie van protoplasten van verschillende weefsels plant werd voor het eerst meer dan 40 jaar geleden gemeld<sup> 1</sup> En is sindsdien aangepast om een verscheidenheid van cellulaire processen, zoals subcellulaire lokalisatie van eiwitten, isolatie van intact organellen en gerichte gen-inactivatie door dubbelstrengs RNA interferentie (RNAi) onderzoek<sup> 2-5</sup>. Het merendeel van de protoplast isolatie protocollen gebruiken blad weefsels van volwassen Arabidopsis (bv. 35-dagen-oude planten)<sup> 2-4</sup>. We gewijzigd bestaande protocollen door het gebruik van 14-dagen-oude Arabidopsis zaailingen. In deze procedure, een gram van de 14-dagen-oude zaailingen leverde 5 10<sup> 6</sup> -10<sup> 7</sup> Protoplasten die intact blijven ten minste 96 uur. De opbrengst van protoplasten van zaailingen is vergelijkbaar met de voorbereidingen van de bladeren van volwassen Arabidopsis, maar in plaats van 35-36 dagen, isolatie van protoplasten is voltooid in 15 dagen. Dit maakt het verminderen van de tijd en de groeikamer ruimte die nodig zijn voor het isoleren van protoplasten als volwassen planten worden gebruikt, en versnelt de downstream studies die intact protoplasten vereisen.
Protocol
Discussion
Om ervoor te zorgen de hoge opbrengst van intacte protoplast is het heel belangrijk om weer te beginnen met gezonde planten. Gebruik filter-steriliseren-oplossingen voor het isoleren van protoplasten. Vergeet niet dat protoplasten kwetsbaar zijn. Daarom, wanneer u protoplasten hanteren, niet mengen, pipet of vortex ze krachtig, omdat het hen zal remmen. In plaats daarvan, mix protoplasten door langzaam draaiende of taping de centrifugebuis. De beschreven procedure opbrengst intact protoplasten die levensvatbaar zijn voo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Cornell University Agricultural Experiment Station (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant en Cornell Start-Up Grant toegekend aan OKV
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma | M5524 | ||
| Agar | Sigma | A1296 | ||
| Petri Dishes (100x15mm) | Kreckeler Scientific | 82-4001 | ||
| Cellulase (Onozuka R‐10) | RPI Corp | C32200 | ||
| Macerozyme (R10) | RPI Corp | M22010 | ||
| Cheesecloth wipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | ||
| Lab Rotator | Fisher Scientific | 1167152Q | ||
| Allegra X‐15R Centrifuge | VWR | 392932 | ||
| Axioskop2 Plus Microscope | Zeiss |
Riferimenti
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
