Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana</em
Summary
Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von intakten Protoplasten aus Geweben des 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis. Da die isolierten Protoplasten intakt bleiben für mindestens 96h und sind aus Sämlingen statt einer Monate alten reifen Pflanzen isoliert, beschleunigt dieses Verfahren Assays erfordert intakte Protoplasten.
Abstract
Protoplasten sind Pflanzenzellen, die hatten ihre Zellwände enzymatisch entfernt haben. Isolation von Protoplasten aus verschiedenen pflanzlichen Geweben wurde erstmals berichtet, mehr als 40 Jahren<sup> 1</sup> Und hat sich seitdem so angepasst, dass eine Vielzahl von zellulären Prozessen, wie subzelluläre Lokalisierung von Proteinen, die Isolierung von intakten Organellen und gezielte Gen-Inaktivierung durch doppelsträngige RNA-Interferenz (RNAi)-Studie<sup> 2-5</sup>. Die meisten der Protoplastenisolierung Protokolle verwenden Blattgewebe von reifen Arabidopsis (zB 35-Tage alte Pflanzen)<sup> 2-4</sup>. Wir modifizierten bestehenden Protokollen durch den Einsatz von 14-Tage alten Arabidopsis-Keimlinge. In diesem Verfahren ergab ein Gramm 14-Tage alte Keimlinge 5 10<sup> 6</sup> -10<sup> 7</sup> Protoplasten, dass intakte mindestens 96 Stunden bleiben. Die Ausbeute an Protoplasten aus Sämlingen ist vergleichbar mit Zubereitungen aus Blättern von Arabidopsis reifen, sondern von 35-36 Tagen, Isolierung von Protoplasten wird in 15 Tagen abgeschlossen. Dies ermöglicht die Verringerung der Zeit und das Wachstum münden, die für die Isolierung von Protoplasten, wenn reifen Pflanzen verwendet werden, erforderlich sind, und beschleunigt den Downstream Studien, dass intakte Protoplasten erfordern.
Protocol
Discussion
Um die hohe Ausbeute an intakten Protoplasten ist es sehr wichtig, um Start-up mit gesunden Pflanzen. Verwenden Sie Filter-sterilisiert Lösungen für die Isolierung von Protoplasten. Beachten Sie, dass Protoplasten zerbrechlich sind. Deshalb, wenn Sie Handling Protoplasten, nicht zu verwechseln, Pipette oder Wirbel zu heftig, da es bremst sie. Stattdessen mischen Protoplasten durch langsam drehende oder Abkleben der Zentrifugenröhrchen. Die beschriebene Vorgehensweise ergeben intakte Protoplasten, die lebensfähig sin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Cornell University Agricultural Experiment Station (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant und Cornell unterstützt Start-Up zum OKV gewährten Zuschusses
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma | M5524 | ||
| Agar | Sigma | A1296 | ||
| Petri Dishes (100x15mm) | Kreckeler Scientific | 82-4001 | ||
| Cellulase (Onozuka R‐10) | RPI Corp | C32200 | ||
| Macerozyme (R10) | RPI Corp | M22010 | ||
| Cheesecloth wipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | ||
| Lab Rotator | Fisher Scientific | 1167152Q | ||
| Allegra X‐15R Centrifuge | VWR | 392932 | ||
| Axioskop2 Plus Microscope | Zeiss |
Riferimenti
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
