El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de 14 días de edad de las plántulas Arabidopsis thaliana</em
Summary
Este video muestra un procedimiento para aislar protoplastos intactos los tejidos de 14 días de edad, las plántulas de Arabidopsis. Dado que los protoplastos aislados permanecen intactos por lo menos durante 96 horas y están aislados de plantas en vez de un mes de edad, las plantas adultas, este procedimiento acelera pruebas que requieren protoplastos intactos.
Abstract
Los protoplastos son células vegetales que han tenido sus paredes celulares enzimáticamente eliminado. El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de plantas se registró por primera vez hace más de 40 años<sup> 1</sup> Y desde entonces ha sido adaptado para el estudio de una variedad de procesos celulares, tales como la localización subcelular de las proteínas, el aislamiento de los orgánulos intactos y de genes diana de la inactivación de doble cadena de ARN de interferencia (RNAi)<sup> 2.5</sup>. La mayoría de los protocolos de aislamiento de protoplastos utilizar tejidos de las hojas de Arabidopsis maduros (por ejemplo, 35 días de edad las plantas)<sup> 2.4</sup>. Hemos modificado los protocolos existentes mediante el empleo de 14 días de edad plántulas de Arabidopsis. En este procedimiento, un programa de 14 días de edad plántulas produjeron 5 10<sup> 6</sup> -10<sup> 7</sup> Protoplastos que permanecen intactos por lo menos 96 horas. El rendimiento de protoplastos de plantas es comparable con los preparativos de las hojas de Arabidopsis madura, pero en lugar de 35 a 36 días, el aislamiento de protoplastos se completa en 15 días. Esto permite disminuir el tiempo y el espacio de cámara de crecimiento que se requieren para el aislamiento de protoplastos de plantas adultas cuando se utilizan, y acelera los estudios posteriores que requieren protoplastos intactos.
Protocol
Discussion
Para asegurar el alto rendimiento de protoplastos intactos, es muy importante para la puesta en marcha de las plantas sanas. Use un filtro a esterilizar soluciones para el aislamiento de protoplastos. Recuerde que los protoplastos son frágiles. Por lo tanto, cuando usted está manejando protoplastos, no se mezclan, pipeta o vortex vigorosamente ya que les freno. En cambio, la mezcla protoplastos girando lentamente o grabar el tubo de centrífuga. El procedimiento descrito protoplastos intactos rendimiento que son viabl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Estación Experimental Agrícola de la Universidad de Cornell (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant y Cornell subvención inicial concedida a OKV
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma | M5524 | ||
| Agar | Sigma | A1296 | ||
| Petri Dishes (100x15mm) | Kreckeler Scientific | 82-4001 | ||
| Cellulase (Onozuka R‐10) | RPI Corp | C32200 | ||
| Macerozyme (R10) | RPI Corp | M22010 | ||
| Cheesecloth wipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | ||
| Lab Rotator | Fisher Scientific | 1167152Q | ||
| Allegra X‐15R Centrifuge | VWR | 392932 | ||
| Axioskop2 Plus Microscope | Zeiss |
Riferimenti
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
