Visualizzazione di Live Drosophila Gliali-giunzione neuromuscolare con tinture fluorescenti

Sommario

Abbiamo descritto le caratteristiche strutturali del Glia-sinapsi neuromuscolare in un preparato romanzo Inside-out tessuto di larve di mosca dal vivo con coloranti fluorescenti con microscopia confocale. Siamo etichettati terminazioni neuronali vivere con anticorpi fluorescenti primario di HRP, e anche visualizzare lo spazio perisynaptic con destrani fluorescenti.

Abstract

Il nostro progetto ha identificato GFP strutture etichettato gliali in via di sviluppo larvale volare sinapsi neuromuscolare. Per vedere lo sviluppo di vivere gliali-neuro-muscolare sinapsi, abbiamo sviluppato una preparazione larvale tessuto che aveva caratteristiche di larve vive intatto, ma ha avuto anche buone proprietà ottiche. Questo nuovo preparato ha anche consentito l'accesso delle perfusates alle sinapsi. Abbiamo usato larve di mosca, immerso in emolinfa artificiale, e rilassato loro normali contrazioni ritmiche del corpo da loro agghiacciante. Poi abbiamo sezionato fuori i segmenti posteriori di ogni animale e con un perno insetti smussato spinto l'apparato boccale indietro attraverso le cavità del corpo. Questo estroflesso il muro larvale corpo, come girare un calzino dentro-fuori. Abbiamo completato la dissezione con finissime forbici dissezione e quindi esposto il lato viscerale dei muscoli della parete del corpo. Le strutture gliali al NMJ espresso GFP mirati membrana sotto il controllo di specifici promotori gliali. La membrana post-sinaptica, la SSR (reticoli Subsynaptic) nei muscoli espresso sinapticamente mirati DsRed. Avevamo bisogno di etichettare acutamente i terminali dei motoneuroni, la terza parte della sinapsi. Per fare questo abbiamo applicato gli anticorpi primari di HRP, coniugata ad un far-rosso flurophore emissione. Per verificare le proprietà di diffusione colorante nello spazio perisynaptic tra i terminali del neurone motore e la SSR, abbiamo applicato una soluzione di grandi molecole destrano coniugato con estrema rosso flurophore emissione e le immagini raccolte.

Protocollo

Parte 1: Preparazione del tessuto

1. Il nostro obiettivo è una preparazione tessuto di larve di mosca in cui il sistema nervoso è intatto, ma la superficie interna del muscolo parete del corpo è esposto a una emolinfa artificiale, e può essere posizionato vicino ad un microscopio copertura antiscivolo per una buona ottica. In altre parole, un dentro e fuori la preparazione larvale.
   
   Poiché i preparativi dei tessuti convenzionali relativi al taglio, pinning e stretching il muscolo parete del corpo, ea volte di rimuovere parte del sistema nervoso, avevamo bisogno di un approccio diverso.
   
   Volevamo che gli animali inside-out perché voleva....

Discussione

Questa procedura permette di lungo termine imaging di vivere proteine ​​etichettati e processi cellulari. La preparazione in loco dei tessuti che abbiamo descritto ha un sistema nervoso centrale integro e funzionante, PNS e circuiti riflessi. Questa preparazione del tessuto ha dei vantaggi rispetto protocolli standard di volare larvale muscolare, in cui si distende il muscolo larvale parete del corpo (quando è appuntato fuori). Lo stretching può alterare la morfologia sinaptica e innescare riflessi contrazioni .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
HL-6: Emolinfa artificiale di Drosophila, con aggiunta di 5 mM di L-glutammato e 2 mM di calcio.	Reagente	N/A	NA	Il L-glutammato 5 mM ha bloccato le contrazioni muscolari. Abbiamo utilizzato L-glutammato di grado molecolare (Sigma). La concentrazione di 2 mM di calcio è prossima ai livelli fisiologici di calcio nell'emolinfa larvale naturale. Riferimenti: Macleod et al. 2002 e Macleod 2004
Destrano, Alex Fluor 680; peso molecolare 10.000, anionico, fissabile	Reagente	Molecular Probes, Life Technologies	D34680	Utilizzare una camera di perfusione di piccolo volume per mantenere basso il volume totale del colorante
Coniugato Anti-HRP-CY5 (caprino)	Reagente	Jackson ImmunoResearch	123-175-021	Diluire 2,0 mg in 1 ml di ddH2O; dividere in aliquote da 4 microlitri. Congelare a –20°C. Diluire un'aliquote in 100 microlitri di HL-6
Kit per etichettatura con anticorpi Alexa 647	Reagente	Molecular Probes, Life Technologies	A10475	Abbiamo preparato un totale di 80 microlitri di anticorpo primario coniugato, conservandolo in aliquote da 2 microlitri. Ogni aliquote è stata diluita in 100 microlitri di HL-6 per l'etichettatura.
Olio per obiettivo formulato su misura, indice di rifrazione 1,3379	Reagente	Cargill Labs	Formulato su misura
Pinzette ultrafini	Strumento	Fine Science Tools	11252-23 o 11295-20
Forbici a molla	Strumento	Fine Science Tools	91500-09
Forbici da taglio ultrafini	Strumento	Fine Science Tools	15200-00
Camera di perfusione serie RC 20	Strumento	Warner Instruments	64-02222
Microscopio confocale a disco rotante	Microscopio	Quorum Technologies	Quorum Wave FX	Montato su microscopio invertito Leica DMI6000