लाइव Visualizing ड्रोसोफिला फ्लोरोसेंट रंजक के साथ जंक्शन Glial neuromuscular
Summary
हम एक उपन्यास अंदर बाहर रहते मक्खी लार्वा confocal माइक्रोस्कोपी के साथ फ्लोरोसेंट रंजक के उपयोग के ऊतक की तैयारी में Glia-neuromuscular synapses के संरचनात्मक सुविधाओं का वर्णन किया. हम लेबल एचआरपी फ्लोरोसेंट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रहते न्यूरॉन टर्मिनलों, और भी फ्लोरोसेंट Dextrans साथ perisynaptic अंतरिक्ष visualized.
Abstract
हमारी परियोजना के विकास लार्वा मक्खी neuromuscular synapse में GFP लेबल glial संरचनाओं की पहचान की. रहते glial तंत्रिका पेशी synapses के विकास को देखो, हम एक लार्वा ऊतक तैयारी है कि जीना बरकरार लार्वा की सुविधाओं था विकसित की है, लेकिन यह भी अच्छा ऑप्टिकल गुण था. इस नई तैयारी भी perfusates के synapse तक पहुँच के लिए अनुमति दी. हम मक्खी लार्वा का इस्तेमाल किया, उन्हें कृत्रिम hemolymph में डूबे, और उन्हें द्रुतशीतन द्वारा अपने सामान्य लयबद्ध शरीर संकुचन आराम. अगला हम dissected प्रत्येक जानवर के पीछे क्षेत्रों और एक कुंद कीट पिन के साथ मुँह भागों शरीर गुहा के माध्यम से पिछड़े धक्का दे दिया. यह अंदर बाहर एक जुर्राब मोड़ की तरह लार्वा शरीर दीवार, everted. हम अल्ट्रा ठीक विच्छेदन कैंची के साथ विच्छेदन पूरा किया और इस प्रकार आंत शरीर दीवार की मांसपेशियों के पक्ष उजागर. NMJ पर glial संरचनाओं झिल्ली glial विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण के तहत लक्षित GFP व्यक्त किया. बाद synaptic झिल्ली, मांसपेशियों में SSR (Subsynaptic Reticula) synaptically लक्षित dsRed व्यक्त किया. हम तीव्रता मोटर न्यूरॉन टर्मिनलों, synapse के तीसरे भाग लेबल की जरूरत है. हम ऐसा करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी एचआरपी लागू, उत्सर्जक दूर लाल flurophore संयुग्मित. मोटर न्यूरॉन टर्मिनलों और SSR के बीच perisynaptic अंतरिक्ष में डाई प्रसार गुण के लिए परीक्षण करने के लिए, हम दूर लाल उत्सर्जन flurophore और एकत्र की छवियों को संयुग्मित बड़े Dextran अणुओं की एक समाधान लागू होता है.
Protocol
Discussion
यह प्रक्रिया रहते लेबल प्रोटीन और सेल प्रक्रियाओं की लंबी अवधि के इमेजिंग परमिट. में सीटू ऊतक प्रस्तुत करने का हम वर्णित एक अक्षुण्ण और कामकाज सीएनएस, पीएन और पलटा सर्किट है. इस ऊतक तैयार करने का ला?…
Acknowledgements
इस परियोजना CIHR और NSERC द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम उड़ उपभेदों व्यक्त dsRed लेबल (बी.जे. लाइन), SSR, UBC और जैव इमेजिंग सुविधा के निर्माण में योगदान करने के लिए कंटिया Jusiak स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. | Reagent | NA | NA | 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma). 2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph. References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004 |
| Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | D34680 | Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low |
| Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) | Reagent | Jackson ImmunoResearc | 123-175-021 | Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6 |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | A10475 | We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling. |
| Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 | Reagent | Cargill Labs | Custom Formulated | |
| Ultra Fine Forceps | Tool | Fine Science Tolls | 11252-23 or 11295-20 | |
| Spring scissors | Tool | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Perfusion Chamber RC 20 Series | Tool | Warner Instruments | 64-02222 | |
| Spinning Disc confocal | Microscope | Quorum | Quorum Wave FX | Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope |
Riferimenti
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
- Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
- Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
