Quantificar Yeast Life Span cronológica por conseqüência de células envelhecidas

Summary

Envelhecimento cronológico em levedura refere-se à perda de viabilidade celular associada ao tempo na fase estacionária. Aqui nós descrevemos um método de alto rendimento para determinar quantitativamente fermento esperança de vida cronológica.

Abstract

A levedura de brotamento<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Provou ser um organismo modelo importante no campo da pesquisa sobre o envelhecimento¹. O replicativa e expectativa de vida cronológica são dois paradigmas estabelecidos usado para estudar o envelhecimento em leveduras. Envelhecimento replicativo é definido como o número de células filhas uma célula mãe solteira fermento produz antes de senescência; envelhecimento cronológico é definido pelo comprimento das células de tempo podem sobreviver em uma não-divisão, o estado de quiescência-like². Nós desenvolvemos um método de alto rendimento para a determinação quantitativa do tempo de vida cronológica. Este método envolve o envelhecimento das células em um meio definido sob agitação e à temperatura constante. Em cada idade-ponto, uma sub-população de células é retirado da cultura de envelhecimento e inoculadas em meio de cultura rico. A alta resolução curva de crescimento é, então, obtido para esta sub-população de células envelhecidas usando uma máquina Bioscreen C MBR. Um algoritmo é então aplicado para determinar a proporção relativa de células viáveis ​​em cada sub-população com base na cinética de crescimento em cada idade-ponto. Este método requer substancialmente menos tempo e recursos em comparação com outros ensaios cronológica vida útil, mantendo a reprodutibilidade e precisão. A natureza de alto rendimento deste ensaio devem permitir grande escala telas genética e química para identificar modificadores de longevidade da novela para mais testes em organismos mais complexos.

Protocol

Parte 1: Preparação das culturas de envelhecimento Cepas raia de interesse dos estoques congelados em placas de ágar YEPD (extrato de levedura 1%, 2% Bacto-peptona, agar 2%, 2% de glicose). Incubar as células em 30 ˚ C durante 48 horas ou até colônias única aparecer. Escolha colônias única e inocular em 5 mL de meio líquido YEPD (extrato de levedura 1%, 2% Bacto-peptona, 2% de glicose) em tubos de ensaio. Crescer culturas durante a noite a 30 ˚ C, mantendo agitação …

Discussion

O alto rendimento cronológica ensaio expectativa de vida aqui descrito é um método eficaz para quantificar o potencial de envelhecimento de um grande número de cepas com alta precisão e de precisão. O principal avanço deste método em relação aos métodos clássicos de determinação de sobrevivência através da contagem de unidades formadoras de colônia (por exemplo, ver ³⁾ é o uso de um dispositivo de leitura shaker / incubadora / placa, como a máquina Bioscreen MBR C para obtenção de curvas …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Bacto Peptone	Reagent	BD	211677
Bacto Yeast Extract	Reagent	BD	288620
Difco Agar	Reagent	BD	214530
Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.	Reagent	MidSci	J630-500G
Amino Acids	Reagent	Sigma
Ammonium Sulfate	Reagent	Spectrum	AM185
Dextrose	Reagent	Fisher	D16-10
Bioscreen C MBR machine	Tool	Growth Curves USA	5101370
Bioscreen 100-well Honeycomb plate	Tool	Growth Curves USA	9502550