Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

Summary

Chronologischer Alterung in Hefe bezieht sich auf den Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen mit der Zeit in der stationären Phase assoziiert. Hier beschreiben wir eine High-Throughput-Verfahren zur quantitativen Bestimmung Hefe chronologische Lebensspanne.

Abstract

Die Bierhefe<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Hat sich als wichtiger Modellorganismus auf dem Gebiet der Alternsforschung werden¹. Die replikativen und chronologische Lebensspanne gibt zwei etablierte Paradigmen zur Untersuchung Altern in Hefe. Replikativen Altern ist wie die Zahl der Tochterzellen einer Hefe Mutter Zelle produziert, bevor Seneszenz definiert; chronologischer Alterung wird durch die Länge der Zeit-Zellen definiert werden kann in einer nicht-teilenden, Ruhe-ähnlichen Zustand zu überleben². Wir haben einen High-Throughput-Verfahren zur quantitativen Messung des zeitlichen Lebensdauer entwickelt. Dieses Verfahren beinhaltet Alterung der Zellen in einem definierten Medium unter Rühren und bei konstanter Temperatur. An jedem Alter-Punkt, ist ein Sub-Population von Zellen aus der Alterung der Kultur entnommen und geimpft in Rich-Wachstumsmedium. Ein hochauflösendes Wachstumskurve wird dann für diese Subpopulation von gealterten Zellen mit einem Bioscreen C MBR-Maschine erhalten. Ein Algorithmus wird dann angewendet, um den relativen Anteil der lebenden Zellen in den einzelnen Sub-Population auf die Wachstumskinetik in jedem Alter-Punkt zu ermitteln. Diese Methode erfordert wesentlich weniger Zeit und Ressourcen im Vergleich zu anderen chronologischen Lebensdauer Assays unter Beibehaltung Reproduzierbarkeit und Präzision. Die High-Throughput-Natur dieses Tests sollte für eine groß angelegte genetische und chemische Bildschirme ermöglichen es, neue Langlebigkeit Modifikatoren für weitere Tests in immer komplexeren Organismen zu identifizieren.

Protocol

Teil 1: Vorbereitung der alternden Kulturen Streak-Stämmen von Interesse aus gefrorenen Beständen auf YEPD Agarplatten (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Agar, 2% Glucose). Inkubieren Sie die Zellen bei 30 ˚ C für 48 Stunden oder bis einzelne Kolonien erscheinen. Wählen Sie einzelne Kolonien und impfen in 5 ml YEPD flüssigen Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Glucose) in Reagenzgläsern. Wachsen Kulturen über Nacht bei 30 ˚ C unter Beibehaltung konstanter Beweg…

Discussion

Die High-Throughput-chronologische Lebensspanne beschriebene Assay ist hier eine effektive Methode zur Quantifizierung der Alterungspotential einer großen Zahl von Stämmen mit hoher Genauigkeit und Präzision. Der primäre Voraus dieser Methode gegenüber klassischen Methoden zur Bestimmung der Überlebenszeit durch Zählen Kolonie-bildenden Einheiten (siehe z. B. ³⁾ ist die Verwendung eines Shakers / Inkubator / Platte Lesegerät wie dem Bioscreen C MBR-Maschine mit hoher Auflösung Wachstumskurven bei erh…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Bacto Peptone	Reagent	BD	211677
Bacto Yeast Extract	Reagent	BD	288620
Difco Agar	Reagent	BD	214530
Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.	Reagent	MidSci	J630-500G
Amino Acids	Reagent	Sigma
Ammonium Sulfate	Reagent	Spectrum	AM185
Dextrose	Reagent	Fisher	D16-10
Bioscreen C MBR machine	Tool	Growth Curves USA	5101370
Bioscreen 100-well Honeycomb plate	Tool	Growth Curves USA	9502550