Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling
Summary
De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes gelabeld met de rode fluorescente kleurstof FM 4-64 om de snelheid van presynaptische blaasje release in hippocampale neuronale culturen te meten.
Abstract
De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes voorzien van FM kleurstof om de snelheid van presynaptische blaasje los te controleren. FM4-64 is een rood fluorescerende amfifiele styrylkleurstoffen kleurstof die integreert in de membranen van synaptische blaasjes als endocytose wordt gestimuleerd. Lipofiele interacties zorgen dat de kleurstof om sterk te verhogen in fluorescentie, dus uitzenden van een helder signaal wanneer geassocieerd met blaasjes en een nominale een toen in de extracellulaire vloeistof. Na een wasstap wordt gebruikt om externe kleurstof te verwijderen binnen de plasmamembraan, wordt de resterende FM geconcentreerd in de blaasjes en wordt dan verwijderd wanneer exocytose wordt veroorzaakt door een andere ronde van elektrische stimulatie. De snelheid van blaasjes release is gemeten vanaf de daaruit voortvloeiende daling van de fluorescentie. Omdat FM kleurstof kan worden toegepast externe en tijdelijk, het is een nuttig hulpmiddel voor het bepalen van de tarieven van de exocytose in neuronale culturen, vooral bij het vergelijken van de tarieven tussen getransfecteerde synapsen en naburige controlegebieden boutons.
Protocol
Discussion
Als 300 actiepotentialen (AP's) is voldoende om tenminste een ronde van blaasje recycling, een laad-stimulus van 300 AP's of meer wordt vaak gegeven aan het etiket van de recycling pool van blaasjes veroorzaken. Hoewel de meer intense laden stimuli, zoals 900 AP, kan toestaan dat een nominale aantal extra blaasjes te worden geëtiketteerd, dit verhoogt ook de hoeveelheid tijd die de kleurstof kan insluiten in extracellulaire membranen, wat leidt tot een grotere niet-specifieke kleuring. Ik heb de wasstap om kritisch om een …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| APV | Sigma | A5282 | ||
| FM 4-64 | Molecular Probes | T-3166 | ||
| CNQX disodium salt | Sigma | C-239 |
Riferimenti
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
