Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania
Summary
Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczone czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym FM 4-64 do pomiaru tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych neuronów hipokampa w hodowli.
Abstract
Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczony FM barwnika do monitorowania tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych. FM4-64 jest czerwony barwnik fluorescencyjny amfifilowych styrylowe, który osadza się w błony pęcherzyków synaptycznych jak endocytozy jest stymulowany. Lipofilowych interakcje powodują barwnika do znacznego zwiększenia fluorescencji, a tym samym emituje jasny sygnał, kiedy wiąże się z pęcherzami i nominalnej jeden, gdy w płynie pozakomórkowym. Po etapie mycia służy do usuwania zewnętrznych barwnik w błonie komórkowej, pozostałe FM jest skoncentrowana w pęcherzyki, a następnie wydalony przy egzocytozy jest wywołane kolejną rundę stymulację elektryczną. Szybkość uwalniania pęcherzyków jest mierzona od spadku w wyniku fluorescencji. Od FM barwnika może być stosowany przejściowo i zewnętrznych, jest to użyteczne narzędzie do ustalania stawek egzocytozy w neuronalnych kultur, zwłaszcza przy porównywaniu kursów pomiędzy transfekowane synaps i sąsiednich Boutons kontroli.
Protocol
Discussion
W 300 akcji potencjałów (AP) jest wystarczające do wywołania co najmniej jedną rundę recyklingu pęcherzyk, załadunku bodziec do 300 punktów lub więcej, jest często stosowany do oznaczania puli recyklingu pęcherzyków. Choć bardziej intensywne bodźce załadunku, takich jak 900 punktów, może pozwolić nominalnej liczby dodatkowych pęcherzyków być znakowane, to także zwiększa ilość czasu barwnika może zamieścić w zewnątrzkomórkowej błony, co prowadzi do barwienia niespecyficzne. Znalazłem płukaniem być krytyczny…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| APV | Sigma | A5282 | ||
| FM 4-64 | Molecular Probes | T-3166 | ||
| CNQX disodium salt | Sigma | C-239 |
Riferimenti
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
