Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 3
Summary
Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression. Teil 3 beschreibt den Prozess der Fluoreszenzmarkierung der amplifizierten RNA aus beiden Gastgeber und virale Proben durch Amino Allyl-Kupplung von Farbstoffen.
Abstract
Die Familie<em> Poxviridae</em> Besteht aus großen doppelsträngigen DNA-Viren enthalten, die ausschließlich im Zytoplasma der infizierten Zellen replizieren. Die Mitglieder des<em> Orthopox</em> Gattung gehören Variola, dem Erreger der menschlichen Pocken, Affenpocken und Vaccinia (VAC), der prototypische Mitglied der Virus-Familie. Innerhalb der relativ groß (~ 200 kb) Vaccinia-Genom gibt drei Klassen von Genen kodiert: frühe, mittlere und spät. Während alle drei Klassen von viral-kodierten RNA-Polymerasen transkribiert werden, dient jede Klasse eine andere Funktion im Lebenszyklus des Virus. Pockenviren nutzen mehrere Strategien zur Modulation der zellulären Umgebung Host während der Infektion. Um Regulierung der Wirt und Virus Genexpression verstehen, müssen wir genomweite Ansätze genutzt werden, um Transkript Fülle von beiden Viren und Wirtszellen zu analysieren. Hier zeigen wir, zeitlicher Verlauf Infektionen von HeLa-Zellen mit Vaccinia-Virus und Sampling-RNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. Beide Gastgeber und virale RNA isoliert und verstärkt für die Hybridisierung an Microarrays zur Analyse der Genexpression.
Protocol
Discussion
Kritische Schritte
Bei der Durchführung der Amino-Allyl-Kupplung, ist es entscheidend, um den Farbstoff in DMSO kurz (weniger als 1 Stunde) vor der Kupplung resuspendieren und sicher kein Wasser in den Farbstoff / DMSO-Mix, wie es mit der aktiven Gruppe auf den Farbstoff reagieren wird. Nicht übertrocknen RNA (kann bis auf 1-2UL anstatt völlig trocken getrocknet werden), und resuspendieren und in dem Bindungspuffer. Während der Kupplungsreaktion, halten Sie die Reaktion in der Dunkelheit, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Whitehead Institute Fellows Funds
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Altro | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
Riferimenti
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