Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 3 descrive il processo di fluorescenza etichettatura RNA amplificato da entrambi host e campioni di virus da aminoacidi accoppiamento allilico di coloranti. Parte 3 di 3.
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Articolo metodologico
Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 3
In questo articolo
Sommario
Abstract
La famiglia
Protocollo
Parte 1: ARNA etichettatura: accoppiamento allilico amino dei coloranti
- Aggiungere 1μg dei campioni ARNA in provette da microcentrifuga 1,5 ml.
- Vuoto a secco i campioni a fuoco basso o nullo fino a quando non sono completamente asciutti. Cap ciascun tubo non appena è asciutto - non asciugare eccessivamente!
- Aggiungi 9μl buffer di accoppiamento a ciascuna provetta e la ARNA delicatamente su vortex per 1 minuto. Centrifugare brevemente per raccogliere il campione sul fondo del tubo, e poi lasciare che il campione sedersi sul ghiaccio.
- Aggiungere 22μl di DMSO di alta qualità per ogni tubo di Cy3 o Cy5 colorante. ....
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Discussione
Passaggi critici
Quando si esegue l'accoppiamento allilico aminoacidi, è fondamentale per risospendere il colorante in DMSO poco (meno di 1 ora) prima dell'accoppiamento e garantire l'acqua non entra nella tintura / DMSO mix, come si reagisce con il gruppo attivo sul colorante. Non asciugare eccessivamente l'RNA (può essere asciugati fino a 1-2uL piuttosto che completamente asciutto), e risospendere bene nel buffer di accoppiamento. Durante la reazione di accoppiamento, tenere .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Whitehead Institute Fellows Fondi
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Pacchetto di coloranti reattivi post-etichettatura CyDye | Reagente | GE Healthcare | RPN5661 | Contiene i coloranti Cy3 e Cy5 |
| Spettrofotometro NanoDrop ND-1000 UV-VIS | Altro | NanoDrop | ND-1000 | O spettrofotometro equivalente |
Riferimenti
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickso....
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Ristampe e permessi
