Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 3
Summary
Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales. Parte 3 describe el proceso de etiquetado fluorescente del ARN amplificado de host y de muestras de virus mediante el acoplamiento de aminoácidos de alilo de los colorantes.
Abstract
La familia<em> Poxviridae</em> Se compone de grandes de doble cadena de ADN que contienen los virus que se replican exclusivamente en el citoplasma de las células infectadas. Los miembros de la<em> Orthopox</em> Género incluyen la viruela, el agente causante de la viruela humana, viruela de los monos, y la vaccinia (VAC), el miembro prototípico de la familia del virus. En el genoma relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia, tres clases de genes están codificados: temprana, intermedia y tardía. Mientras que las tres clases son transcritos por la forma viral codificada ARN polimerasas, cada clase tiene una función diferente en el ciclo de vida del virus. Poxvirus utilizar múltiples estrategias para la modulación del ambiente celular del huésped durante la infección. Con el fin de entender la regulación de host y la expresión de genes del virus, hemos utilizado todo el genoma enfoques para analizar la abundancia de transcripción de los dos virus y las células huésped. Aquí, demostramos las infecciones tiempo del curso de las células HeLa con virus de la vacuna y el ARN de muestreo en varios puntos temporales después de la infección. Tanto del huésped como del ARN viral total es aislado y amplificado por la hibridación de microarrays para el análisis de la expresión génica.
Protocol
Discussion
Los pasos críticos
Al realizar el acoplamiento de alilo amino, es muy importante para volver a suspender el tinte en DMSO en breve (menos de 1 hora) antes del acoplamiento y asegurarse de que no entra agua en la mezcla de tinta / DMSO, ya que reacciona con el grupo activo en el medio de contraste. No resecar el ARN (se puede secar a 1-2UL en lugar de secar por completo), y resuspender bien en el tampón de acoplamiento. Durante la reacción de acoplamiento, que la reacción en la oscuridad, c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los becarios del Instituto Whitehead Fondos
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Altro | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
Riferimenti
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