Homarus americanus Stomatogastric dissection du système nerveux

Summary

Nous décrivons la dissection fine du système nerveux stomatogastric de l'estomac du homard américain (<i> Homarus americanus</i>).

Abstract

Dans le but de comprendre comment les systèmes nerveux produisent une activité et de répondre à l'environnement, les neuroscientifiques se tourner vers des systèmes modèles qui présentent l'activité d'intérêt et sont accessibles et se prêtent à des méthodes expérimentales. Le système nerveux stomatogastric (STNS) du homard d'Amérique (<i> Homarus americanus</i>; Savons aussi été le homard de l'Atlantique ou du Maine) a été établi comme un système modèle pour étudier le rythme générant des réseaux et des réseaux de la neuromodulation. Le STNS se compose de 3 ganglions antérieurs (2 ganglions commissuraux et un ganglion de l'oesophage), contenant des neurones modulateurs ce projet au niveau central pour le ganglion stomatogastric (STG). Le STG contient environ 30 neurones qui comprennent deux réseaux motif central de production, les réseaux pylorique et gastrique qui sous-tendent les comportements alimentaires dans les crustacés^1,2. Bien qu'il soit possible d'étudier ce système<i> In vivo</i³, Le STNS continue à produire ses activités rythmiques lorsqu'ils sont isolés<i> In vitro</i>. L'isolement physique de l'STNS dans un plat permet d'accéder facilement à l'soma dans les ganglions des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires et les nerfs de la STNS pour les enregistrements extracellulaires. Isoler le STNS est un processus en deux parties. La première partie, la dissection de l'estomac de l'animal, est décrite dans un article accompagnant la vidéo⁴. Dans cet article, vidéo, techniques de dissection fine sont utilisées pour isoler l'STNS de l'estomac. Cette procédure aboutit à une préparation du système nerveux qui est disponible pour les enregistrements électrophysiologiques.

Protocol

Avant de commencer ce protocole de l'estomac du homard doit être retiré de l'animal et préparé comme décrit dans l'article compagnon Jove (Bierman & Tobin, 2009). La majorité des étapes décrites ci-dessous doivent être effectuées sous un microscope de dissection. Partie I-Isoler les ganglions commissurales Orienter l'antenne afin que l'extrémité antérieure (par la lèvre) est loin de vous et l'extrémité postérieure (par le pylore) est vers vous. Assurez-vous que l'estomac est tombé de sorte qu'elle repose aussi plat que possible sur le plat. Pin dans l'œsophage, de chaque côté de la lèvre. Si nécessaire, réorganiser les autres broches placées lors de la dissection brut. Retirez l'hypoderme. Prenez l'hypoderme près de la gm2/gm3 muscles, il se détacher de ces muscles et tirez doucement dans la direction antérieure. Séparée de l'hypoderme de la graisse sous-jacente en coupant les connexions. Utilisation accrue de soins autour de l'artère centrale, qui renferme un élément clé du système stomatogastric nerveux. Laisser l'hypoderme intacte dans un rayon de 0,5 cm du ganglion stomatogastric, qui se trouve entre les muscles gm1b. Coupez hypoderme séparés. Détachez le cerveau à partir des tissus sous-jacents. Identifier les deux grands nerfs commissuraux ce projet bilatéral de la partie antérieure du cerveau vers les ganglions commissuraux dans la partie antérieure de l'estomac. Laissant ces nerfs intacts, soulevez doucement le cerveau avec une pince et couper pour séparer le cerveau du reste du tissu. Soyez prudent car vous faites cela, comme le nerf stomatogastric est en dessous du cerveau et doit être conservée intacte. Séparez les ganglions commissuraux partir entourant le tissu. Suivez l'un des nerfs commissuraux à l'un des ganglions commissuraux. Identifier les ions et fils – ces nerfs doivent rester intactes. Le ganglion commissural aura beaucoup de nerfs rayonnant. Couper plupart d'entre eux (à l'exception de l'ion et fils), mais laissez un nerf supplémentaire attaché à maintenir le ganglion commissural en place pendant que vous finissez la dissection. Répéter avec le ganglion d'autres commissurales. Nettoyer l'ion et son fils de dehors en dedans. Laisser le nerf vestibulaire intacte pour ancrer le système nerveux de l'estomac. Le ganglion œsophagien siège étaient les ions s croisent. Vous pouvez effacer dessous en saisissant le nerf ventriculaire inférieur et tirant vers le haut pour couper en-dessous. Partie II-Isoler le ganglion Stomatogastric (STG) et les nerfs restants. Séparez les STG à partir entourant le tissu. Le STG est assis à l'intérieur d'une artère qui passe entre les muscles gm1b et jusqu'à la gm2a, les muscles b. Cherchez l'extrémité coupée de l'artère près les muscles gm2a b,. Tirez l'extrémité coupée de l'artère et en avant, pour exposer le DVN. Continuez de tirer jusqu'à ce que vous atteigniez le niveau de l'hypoderme restant. Une fois séparés, l'artère peut être coupé au niveau où il touche l'hypoderme restant. Coupez le lambeau musculaire qui était situé dans la tribune de la langouste. Soulevez l'hypoderme dessus de l'artère, en observant que l'artère fait un tunnel à l'intérieur de la graisse au-dessus du STG. Mettez une lame de vos ciseaux intérieur de l'artère et couper le muscle au-dessus. Vérifiez que vous pouvez voir les dvn que vous avez coupé pour être sûr que vous êtes en sécurité au-dessus du STG. Continuer la coupe antérieure, suite à l'artère. Comme vous le cran au-dessus de la STG, vous serez capable de voir les STN émanant antérieure de la STG et le bas de plongée dans le muscle. Continuer la coupe antérieurement à séparer complètement les muscles au-dessus du STG. Effacer tout tissu loin de la STN. Séparez les agn s du tissu environnant. (Même si vous ne prévoyez pas d'enregistrer à partir de l'AGN, vous aurez besoin d'une portion du nerf intact pour épingler le ganglion pour des enregistrements intracellulaires.) Pour mieux voir le s agn, retirez l'hypoderme restant et une fine couche de muscle sous-jacent. Juste postérieure à la STG, d'identifier un tunnel sombre dans la graisse et les muscles de chaque côté de la DVN. Collez une lame de ciseaux à l'intérieur du tunnel et couper le tissu au-dessus du nerf. Continuer de coupe latérale, suivant le nerf, de l'isoler. (A quelques millimètres est suffisante pour épingler le ganglion, mais exposent au moins 5 mm de l'AGN si vous envisagez d'enregistrer à partir de lui.) Détachez l'AGN du muscle qu'il innerve en coupant les connexions. Répétez de l'autre côté pour isoler l'AGN autres. Une fois les deux s agn ont été disséqués, couper tous les muscles et les tissus reliant les STG à l'estomac. Isoler l'art mvn Ils sont une paire bilatérale de petits nerfs qui bifurque de la LVN et traversant latéralement au-dessous de la graisse. Soit utiliser des ciseaux ou deux pinces pour couper à travers la graisse sur un côté de la DVN, près du lieu où elle se ramifie dans le s. Deux lvn Ici, vous êtes loin de la s mvn et ne seront pas de risque de les couper. Soulevez la couche de graisse, et d'identifier les sous mvn petits. Ces nerfs courir latéralement en dedans juste derrière au niveau des muscles gm1b. Retirer la couche de graisse au-dessus du mvn, laissant le nerf intact pour aujourd'hui afin de ne pas s'emmêler. Vous aurez réduire ses extrémité latérale de dessus l'estomac à la fin de la dissection. Répétez le processus de l'autre côté pour isoler les mvn autres. Isoler le s LVN et les nerfs postérieurs. À partir là où la succursale de la LVN s latéralement hors de la DVN, suivre un LVN en coupant le gras dessus. Selon la préparation, parfois toute la couche grasse au-dessus du nerf peut être retiré. Continuer révélant les LVN jusqu'au point où les branches hors PSN. Isoler le PYN. Localisez le PYN, il est un nerf voyageant arrière sur le pylore. Retirer la fine membrane qui couvre cette région. Isoler le PYN en coupant une petite section du pylore, attaché à la PYN. Soulevez doucement la section du pylore et couper le tissu de chaque côté de l'PYN jusqu'à atteindre la branche qui s'attache à la PDN. Isoler le PDN. Localisez le PDN, il est un nerf voyageant en arrière du muscle dilatateur du pylore. Coupez une petite section du muscle dilatateur du pylore, attaché à la PDN. Soulevez doucement la section dilatateur pylorique muscle, coupé le tissu de chaque côté de la PDN jusqu'à atteindre la branche qui s'attache à la PYN. Isoler le lvn ventrale, qui connecte le PYN et PDN de la LVN. Au point où la branche de forme triangulaire et PYN pdn connecter au lvn ventrale, isoler toute petite section de nerf qui bifurque de la LVN ventrale, comme le vpln. Il sera utilisé comme une poignée pour tirer sur les LVN ventrale. Soulevez la poignée et couper le tissu de chaque côté de l'lvn ventrale, qui travaillent dans le sens antérieur jusqu'à atteindre le point où les branches hors PSN. Répétez les étapes 10 – 13 à isoler les nerfs lvn et postérieure de l'autre côté. Détachez le système nerveux stomatogastric de l'estomac. Pour bien détacher le lvn de l'estomac, tirez sur le PSN et couper tous les tissus et les nerfs rattachés à la lvn et lvn ventrale, sauf pour les PDN et PYN. Répétez ce processus sur l'autre côté. Coupez l'extrémité latérale de chaque mvn. Soulevez l'extrémité latérale et couper toutes les pièces jointes étrangers entre le nerf et le tissu de l'estomac sous-jacent. A l'extrémité antérieure, couper toutes les pièces jointes étrangers vers les ganglions commissuraux, et couper le nerf labiale sur chaque côté. Visuellement le système de balayage du système nerveux stomatogastric à identifier, puis couper les pièces jointes supplémentaires pour le tissu estomac. S'accrocher à l'extrémité antérieure des deux nerfs commissuraux, au-dessus des ganglions commissuraux, et le zeste du système nerveux stomatogastric hors de l'estomac et le déplacer vers le côté du plat. Comme vous faites cela, couper toutes les pièces jointes restent à libérer le système nerveux. Préparer le plat Sylgard petits. Frotter certains tissus de l'estomac à fond sur la surface de la Sylgard dans le petit plat. Cela diminuera l'hydrophobie de la Sylgard, de sorte que salée va distribuer uniformément dans le plat. Rincer et remplir le plat avec une solution saline réfrigérée Sylgard. Transférer le système nerveux pour le plat préparé par Sylgard saisissant les extrémités antérieures des deux nerfs commissuraux, en soulevant le système nerveux de la grand plat, et il pose dans le petit plat. Epingler la STNS dans le petit plat en utilisant une combinaison de broches Minuten et plus mince broches réduit de fil de tungstène. Assurez-vous que la préparation est face dorsale en vérifiant que le nerf ventriculaire inférieure est dirigée vers l'extérieur de la Sylgard. Enlever le cerveau et les nerfs commissuraux broches. Tirez doucement sur ​​le système nerveux serrés et plat en tirant chacun des s psn en arrière et latéralement, et les épingler le bas. Retirer le muscle dilatateur de l'pylore s PDN, et la broche à l'art pdn Retirez lesegment de pylorique de l'PYN s, et une épinglette à l'art PYN Pin bas de nerfs qui restent isolés tels que les nerfs labiaux, le s mvn et AGN s. Desheath le STG. Assurer la STG est à plat contre le Sylgard et tendue par les latéraux s agn, la partie antérieure et la STN dvn postérieur. Organiser l'éclairage pour permettre la visualisation des axones dans le DVN. En utilisant une épingle ou d'aiguille de tungstène fine, faire un petit trou peu profond dans la gaine entourant les DVN, juste derrière le STG. Retirez l'aiguille à travers le DVN, dorsale de l'axone, pour créer une déchirure horizontale dans la gaine des nerfs. Prenez le rabat de la gaine nerveuse postérieure à la STG et tirez vers l'avant pour enlever la gaine de la face dorsale du STG. Abréviations: STNS Stomatogastric du système nerveux STG Ganglionnaires Stomatogastric CoG Ganglionnaires commissurales STN nerveuses stomatogastric mvn nerveuses du ventricule médial ions inférieure du nerf oesophagien le fils supérieure du nerf oesophagien AGN nerveuses antérieures gastriques dvn nerveuses du ventricule dorsale LVN nerveuses du ventricule latéral psn nerveuses estomac postérieure vpln nerveuse ventrale latérale postérieure PYN nerveuses du pylore pdn nerf dilatateur pylorique

Discussion

L'anatomie de l'estomac homard et STNS a été bien décrit précédemment ^5,6, et les variations de cette procédure de dissection ont été utilisés dans de nombreuses études. Nous vous recommandons de vous familiariser avec l'anatomie de l'estomac ^5-7 et STNS ^5,8 avant dissections début. Familiarité va diminuer le risque de dommages accidentels aux nerfs et les tissus.

Pour maintenir la santé de la préparation, il est essentiel de maintenir la préparation à une température fraîche. Ceci est facilement réalisé par l'échange des salines toutes les 30 minutes avec 4 ˚ C salée conservée dans un réfrigérateur. Lorsqu'elle a été immergée dans une solution saline froide, la préparation isolée STNS est viable pendant de nombreuses heures. Enregistrements en gammarus Homarus connexes ont démontré stables activité rythmique de la STG à travers cinq jours in vitro, ^9; robustesse similaire a été vu dans H. americanus (obs. pers.).

D'entrée de modulation de la STG des ganglions commissuraux est nécessaire pour préserver les schémas moteurs en cours. Par conséquent, pour maintenir une activité normale rythmiques ces ganglions et de l'ion, le fils, et les nerfs STN doivent être conservées intactes. La dissection nous décrivons préserve les nerfs moteurs de plusieurs (contenant les axones des neurones moteurs): le s agn (contenant moulin gastrique (GM) axones), la commande mvn s (contenant gastrique latéral (LG) et inférieur cardiaque (IC) axones), le s PYN (contenant pylorique neurone (PY) axones), le s pdn (contenant Dilatateur pylorique (PD) axones), et le s lvn (contenant pylorique latéral (LP), gastrique Médial (MG), les axones GPL ainsi que ceux de GM, PD et PY). En disséquant supplémentaires (ou différentes) les nerfs, les autres moteurs axones des neurones peut être enregistré. Chaque type individuel de l'axone des neurones moteurs peuvent être enregistrées individuellement par la dissection et l'enregistrement du nerf innervant le muscle auquel ce type de projets neurone.

Cette préparation peut être utilisée pour une variété d'études ont porté sur la fonction du système nerveux. L'activité des neurones peut être enregistrée en utilisant soit intracellulaire, les enregistrements d'électrode forte du soma ou axones, ou par l'enregistrement des impulsions électriques extracellulairement des nerfs. Beaucoup de canaux ioniques dans les neurones STG ont été partiellement cloné et ARNm peut être mesuré à partir de ^10,11 tirée manuellement soma.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter)	Tool	California Fine Wire		Cut into 1-2mm pieces to use as fine pins.
Forceps #5	Tool	FST	91150-20
Minuten Pins	Tool	FST	26002-10
Moria Spring Scissors (7mm blades)	Tool	FST	15370-52	These are the top of the line. There are more economical spring scissors available from the same company.
Petri Dish (100x15mm)	Tool	Fischer	08-757-12	Fill 2-4mm with Sylgard 182.
Sylgard 182	Altro	Dow Corning	182
Pin Holder	Tool	FST	26018-17	Optional. Desheathing can be done with scissors and fine forceps alone.
Super fine forceps #5SF	Tool	FST	11252-00
Tungsten Needles	Tool	FST	10130-05	Optional. Desheathing can be done with scissors or with pins cut from fine tungsten wire.
Dissection microscope