Proteomik för att identifiera proteiner Interagera med P2X2 ligandreglerade munikationsvägar
Summary
Vi beskriver ett enkelt protokoll för att identifiera hjärnan proteiner som binder till hela längden C ändstationen av ATP-gated P2X2 receptorer. Utbyggnaden och systematisk tillämpning av denna metod till alla P2X receptorer förväntas leda till en bättre förståelse för P2X receptor signalering.
Abstract
Ligandreglerade jonkanaler ligger bakom synaptisk kommunikation i nervsystemet 1. Hos däggdjur finns det tre familjer av ligandreglerade kanaler: CYS slinga, glutamatreglerade och P2X kanalerna receptor 2. I varje fall bindning av sändare leder till öppnandet av en por genom vilken joner rinna ner sina elektrokemiska gradienter. Många ligandreglerade kanaler också släpper igenom kalciumjoner 3, 4, som nedströms har signalering roller fem (t.ex. genreglering) att ha längre varaktighet av kanal öppning. Således ligandreglerade kanaler kan signalera över breda tidsskalor från några få millisekunder till dagar. Med tanke på dessa viktiga roller är det nödvändigt att förstå hur ligandreglerade jonkanaler sig regleras av proteiner, och hur dessa proteiner kan ställa signalering. Färska studier tyder på att många, om inte alla, kan kanalerna vara en del av protein signalering komplex sex. I den här artikeln förklarar vi hur man kan identifiera de proteiner som binder till C-terminalen aspekter av P2X2 receptorn cytosoliska domän.
P2X receptorer är ATP-gated munikationsvägar och består av sju subenheter (P2X1-P2X7). P2X receptorer är allmänt uttryckta i hjärnan, där de förmedlar excitatoriska synaptisk transmission och presynaptiska underlättande av signalsubstansen släpper 7. P2X receptorer finns i hetsiga och icke-retbara celler och medla nyckelroller i neuronal signalering, inflammation och kardiovaskulär funktion 8. P2X2 receptorer är rikligt i nervsystemet 9 och är i fokus för denna studie. Varje P2X subenhet är tänkt att ha två membran som spänner segment (TM1 & TM2) separerade av ett extracellulärt region 7 och intracellulära N och C ändstationer (Fig 1a) 7. P2X subenheter 10 (P2X1-P2X7) visar 30-50% sekvenshomologi på aminosyra nivå 11. P2X receptorer innehåller bara tre subenheter, som är den enklaste stökiometri bland ionotropic receptorer. Den P2X2 C-terminal består av 120 aminosyror (Fig 1b) och innehåller flera protein webbplatser dockning konsensus, stöder hypotesen att P2X2 receptor kan vara en del av signalering komplex. Trots att flera funktioner har tillskrivits C-ändstationen av P2X2 receptorer 9 ingen studie har beskrivit de molekylära partners som par till den intracellulära sidan av detta protein via fulla längd C-terminal. I den här metoder dokument beskriver vi ett proteomik metod för att identifiera de proteiner som interagerar med full längd C-ändstationen av P2X2 receptorer.
Protocol
Discussion
Jonkanaler är en stor klass av integrerade membranproteiner. De innehåller vattenfyllda porer som selektivt tillåta förflyttning av joner ner sina elektrokemiska gradienter över plasmamembranet. Jonkanaler grind mellan öppna och slutna stater. Det gating steget är utlöses av sändare (t.ex. ATP) vid P2X ligandreglerade jonkanaler, eller det kan regleras av interaktioner med andra proteiner. Det senaste decenniet har bevittnat en ökning av vår förståelse av hur P2X receptorer binder ATP-13, men rol…
Acknowledgements
SW och TMV stöds av NCRR och NHLBI vid National Institutes of Health. BSK och HS stöds av NINDS och NIGMS av National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | BIO-RAD | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | BIO-RAD | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | BIO-RAD | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick&Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | ThermoFisher Scientific | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M6250 | |
| Glycerol | EMD | GX0185-6 |
Riferimenti
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).
- Burnashev, N. Calcium permeability of ligand-gated channels. Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Khakh, B. S., North, R. A. P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease. Nature. 442, 527-532 (2006).
- Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding. J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).
- Khakh, B. S. International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits.. Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).
- Young, M. T. Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy. J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).
- Edmondson, R. D. Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS. Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).
- Evans, R. J. Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors. Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).
