P2X2 Ligandla Gated Katyon Kanalları ile etkileşimde Proteinler tanımlamak için Proteomik
Summary
Biz, ATP-kapılı P2X2 reseptörlerinin tam uzunlukta C terminus bağlamak beyin proteinleri tespit etmek için basit bir protokol açıklar. Bu yaklaşımın uzantısı ve sistematik bir uygulama tüm p2x reseptörlerine p2x reseptör sinyal daha iyi anlaşılmasına yol açması bekleniyor.
Abstract
Ligand kapılı iyon kanalları sinir sistemi 1 sinaptik iletişim yatar. Memelilerde ligand kapılı kanallar üç aile vardır: CYS döngü, glutamat-kapılı ve p2x reseptör kanal 2. Her iki durumda da verici bağlayıcı ionlar elektrokimyasal gradyanlar aşağı akan bir gözenek açılması yol açar. Birçok ligand kapılı kanallar da downstream kanal açma süresini aşamaz rolleri sinyalizasyon 5 (örneğin gen regülasyonu) kalsiyum iyonları 3, 4, geçirgen. Böylece ligand kapılı kanallar gün birkaç milisaniye arasında değişen geniş bir zaman ölçekleri üzerinde sinyal. Ligand kapılı iyon kanalları kendilerini proteinler tarafından düzenlenir anlamak için gerekli olduğunu ve bu proteinlerin nasıl bu önemli rolleri dikkate alındığında sinyal ayar olabilir. Son çalışmalar, pek çok, hepsi değilse de, kanal protein sinyalizasyon kompleksleri 6 parçası olabilir ki öneririz . Bu yazıda, P2X2 reseptör sitozolik etki C-terminal yönlerine bağlayan proteinleri tespit etmek için nasıl.
P2x reseptörler ATP açılıp kapanan katyon kanalları ve yedi alt birimden (P2X1-P2X7) oluşur. P2x reseptörler eksitatör sinaptik iletim ve nörotransmiter sürüm 7 presinaptik kolaylaştırma arabuluculuk beyin, yaygın olarak ifade edilir. P2x reseptörleri heyecanlanır ve non-Uyarılabilir hücrelerinde bulundu ve nöronal sinyalizasyon, inflamasyon ve kardiyovasküler fonksiyon 8 kilit roller arabuluculuk. P2X2 reseptörler, sinir sistemi 9 bol ve bu çalışmanın odak vardır . Her p2x altbirim ekstraselüler bölge 7 ve hücre içi N ve C Termini (Şekil 1a) 7 ile ayrılmış iki membran kapsayan kesimleri (TM1 ve TM2) sahip olduğu düşünülmektedir. P2x alt birimden 10 (P2X1-P2X7), amino asit düzeyi 11% 30-50 dizisi homoloji göstermektedir . P2x reseptörleri iyonotropik reseptörler arasında basit stokiyometri sadece üç alt birimden içerir. P2X2 C-terminalindeki 120 amino asitler oluşur (Şekil 1b) ve P2X2 reseptör sinyal komplekslerinin parçası olabileceği hipotezini destekleyen birkaç protein yerleştirme konsensüs siteleri içerir. Ancak, çeşitli işlevleri P2X2 reseptörleri 9 C-terminalindeki atfedilmiş olmasına rağmen hiçbir çalışma moleküler ortakları açıklanan bu proteinin hücre içi tarafında tam uzunlukta C-terminalindeki üzerinden çift. Bu yöntem kağıt tam uzunlukta C-terminalindeki P2X2 reseptörleri ile etkileşen proteinleri tespit etmek için bir proteomik yaklaşım açıklar.
Protocol
Discussion
İyon kanalları büyük bir integral membran proteinleri sınıfı. Onlar kendi elektrokimyasal gradyanlar aşağı seçici plazma zarından iyonların hareketi izin su dolu gözeneklerin içerir. İyon kanalları kapısı açık ve kapalı devletler arasında. Yolluk adım p2x ligand kapılı iyon kanalları halinde vericileri (örneğin ATP) tarafından tetiklenir, ya da diğer proteinler ile etkileşimler tarafından düzenlenmiş olabilir. Son on p2x reseptörler ATP 13 bağlama nasıl anlayışımızı …
Acknowledgements
SW ve TMV Ulusal Sağlık Enstitüleri NCRR ve NHLBI tarafından desteklenmektedir. BSK ve HS, Ulusal Sağlık Enstitüleri NINDS ve NIGMS tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | BIO-RAD | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | BIO-RAD | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | BIO-RAD | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick&Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | ThermoFisher Scientific | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M6250 | |
| Glycerol | EMD | GX0185-6 |
Riferimenti
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).
- Burnashev, N. Calcium permeability of ligand-gated channels. Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Khakh, B. S., North, R. A. P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease. Nature. 442, 527-532 (2006).
- Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding. J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).
- Khakh, B. S. International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits.. Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).
- Young, M. T. Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy. J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).
- Edmondson, R. D. Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS. Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).
- Evans, R. J. Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors. Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).
