Zebrafisk Brain kammare Injection

Summary

Efter neuralröret bildas kontraherar den neuroepithelium och veck medan röret fylls med embryonala cerebrospinalvätska (eCSF) för att bilda den embryonala hjärnan ventriklar. Vi utvecklade denna kammare injektionsteknik för att bättre visualisera vätskefyllda utrymme i kontrast till neuroepiteliala form i ett levande embryo.

Abstract

Korrekt hjärnan kammare bildas under fosterutvecklingen hjärnans utveckling behövs för normal hjärnfunktion. Ventriklar i hjärnan är de starkt konservativa hålrum i hjärnan som är fyllda med cerebrospinalvätska. I zebrafisk, efter neuralröret bildas, genomgår neuroepithelium en serie av sammandragningar och rynkor samtidigt som den fylls med vätska vilket resulterar i hjärnan kammare bildas. För att förstå processen att ventrikeln bildas, och neuroepiteliala ändrar form som sker samtidigt behövde vi ett sätt att visualisera ventrikeln utrymme i förhållande till hjärnvävnaden. Gör dock den typ av genomskinliga zebrafisk embryon svårt att skilja vävnad från ventrikeln rymden. Därför utvecklade vi en hjärna teknik kammare injektion där ventrikeln utrymmet är fyllt med en fluorescerande färg och avbildat av brightfield och fluorescerande mikroskopi. Den brightfield och fluorescerande bilderna bearbetas sedan och överlagras i Photoshop. Denna teknik gör det möjligt för visualisering av ventrikeln rymden med fluorescerande färg, i jämförelse med formen på neuroepithelium i brightfield bilden. Brain ventrikeln injektion i zebrafisk kan användas från 18 timmar efter befruktning genom tidiga larvstadier. Vi har använt denna teknik i stor utsträckning i våra studier av hjärnans ventrikeln bildning och morfogenes samt karakterisera mutanter hjärnan morfogenes (1-3).

Protocol

Protokoll Del 1: Förberedelser för mikroinjektion Förbered för injektion genom att dra kapillär nålar med Sutter Instrument nål avdragare. Fyll nålen med en fluorescerande färg (till exempel Texas-Red Dextran). Montera nålen i en mikromanipulator och mikroinjektion apparater. Skär nålen till lämplig storlek i en vinkel för att skapa en fasad spets. Mät droppstorlek och kontrollera att det är mellan 1-2nl per injektion i olja. </…

Discussion

I denna video visar vi hur du ska injicera fluorescerande färg (Texas-Red Dextran) att utveckla zebrafisk hjärnans ventriklar. Denna metod används för att visualisera det utrymme hjärnan kammare i kontrast till det omgivande neuroepithelium och är mycket användbart för att bestämma formen på ventrikeln utrymme samt formen på den omgivande hjärnvävnaden. Det ger oss möjlighet att bättre förstå processen i hjärnan ventrikeln bildas och hjärnan morfogenes över tiden i den levande embryo. Denna teknik ä…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-20
Capillary Tubes (needles)	Tools	Frederick Haer and Co.	30-30-1
Agarose-Coated dishes	Tools	Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)	Agarose (50027) Dishes (430166)	Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope	Microscope	Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software	Tools
1-200 μ pipette tips	Tools	Tip One, US Scientific	1111-0806	These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop	Image Analysis	Adobe
Embryo Loop	Tools			Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector	Tools	Medical Systems Research Products Harvard Apparatus	PL1-100
Needle Puller	Tools	Sutter Instruments		Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).
Micromanipulator	Tools	Narishige
Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW	Reagent	Molecular Probes	D1830	Other Molecular weights are available if desired.
Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester)	Reagent	Sigma	A-5040
Embryo Media	Reagent			According to Westerfield (5)