S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별
Summary
여기 Saccharomyces cerevisiae의에서 단백질 단지를 식별하기위한 새로운 양적 proteomics 기술을 설명합니다. 본 연구에서는, 우리는 높은 특이성과 ER 단백질 Scs2p의 바인딩 파트너를 식별하는 탠덤 질량 분석계 다음 친화 정화와 함께 SILAC 방법을 사용했습니다.
Abstract
Lipids 중요한 세포 신호 전달 분자로, 최근에는 장벽로서 세포 프로세스 compartmentalization에서 세포 세포막 그 함수의 빌딩 블록이며,. 그러나, 단백질과는 달리, lipids 작은 소수성 분자는 것을 주로 막 연락처 사이트 (MCSs)에서 발생하는 가상 아르 제대로 설명 nonvesicular 경로로 트래픽. MCSs는 endoplasmic reticulum (ER)가 제휴 organelle, 예를 들어, 플라즈마 멤브레인 (PM)와 직접적인 신체 접촉을 만드는 지역입니다. ER – PM MCSs의 ER 부분은 그 지질 합성이 해당 사이트로 이동하고 MCSs는 지질 트래픽 중요하다는 것을 뜻합니다 제안, 지질 합성 효소에 풍부합니다. 효모는 1000 셀 당 연락처 및 모든 eukaryotes에서 보존 자연과, 때문에 그들의 풍요의 ER – PM MCSs를 공부하는 이상적인 모델입니다. MCSs을 구성하는 단백질을 잠복하면 lipids 트래픽이 세포에 달성하는 방법 이해하는 것이 중요합니다, 그들은 신호 분자 역할을하는 방법. 우리는 Scs2p라는 ER은 ER – 오후 MCSs에 집중 발견과 형성에 중요합니다. 우리는 Scs2p의 분자 파트너 잠복에 초점을 맞추고 있습니다. 단백질 단지의 확인은 전통적으로 첫번째 질량 분광법에 의해 펩티드의 단백질 밴드와 분석에 – 젤 소화 다음 겔 전기 영동에 의해 정제된 단백질 샘플을 해결에 의존합니다. 이것은 종종 단백질의 작은 하위 집합에 대한 연구를 제한합니다. 또한, 단백질 단지는 절차를 수행하는 동안 denaturing 또는 이외의 생리 조건에 노출되어 있습니다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 우리는 편견과 계량 데이터를 추출하기 위해 대규모 양적 proteomics 기술을 구현했습니다. 우리는 태그가 지정되지 않은 제어 변형에 단백질의 주요 동위 원소의 핵을 통합하기 위해 세포 배양에서 아미노산 (SILAC)와 안정 동위 원소 라벨을 사용합니다. 태그 문화와 태그가 지정되지 않은, SILAC – 레이블 문화의 동등 권 함께 혼합하여 액체 질소에 연삭에 의해 lysed 있습니다. 그러면 단백질 단지를 잡아 친화 정화 절차를 수행합니다. 마지막으로, 우리는 고성능 액체 크로마 토그래피 / 탠덤 질량 분석계로 분석을위한 준비가 단백질 샘플을 촉진. 가장 중요한 것은, 제어 변형에 단백질은 무거운 동위 원소에 의해 표시되고 미끼 변형에 레이블이 지정되지 않은 단백질에 대한 계량 수있는 질량 / 비용 변화를 생산합니다. 따라서, 오염 물질, 또는 unspecific 바인딩을 쉽게 제거하실 수 있습니다. 이 접근법을 사용함으로써, 우리는 ER – 오후 MCSs에 집중 여러 소설 단백질을 발견했습니다. 여기 우리는 우리의 접근 방법에 대한 자세한 설명을 제시한다.
Protocol
Discussion
정화 절차를 수행하는 동안 저장된 aliquots (1) 사전 허가 세포 lysate, (2) 바운드 분수 (3) 언바운드 분율, 그리고 (4) eluted 소수를 포함해야합니다. 우리는 실험의 바인딩과 eluting 효율성을 반영하기 위해 안티 – TAP 항체 또는 실버 얼룩을 사용하여 모래 바닥 서양하여 위의 aliquots의 단백질 내용을 분석하는 것이 좋습니다. 은색 스테인드 젤과 얼룩의 예는 그림 1에 표시됩니다.
SIL…
Riferimenti
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