マウス神経組織から単細胞懸濁液の生成

Summary

特定の組織型から解離し細胞が組織aggitationのための特定のパラメータは、実行可能な、培養可能な細胞の大量を取得する必要があります。ミルテニーgentleMACS Dissociatorは、シンプルで実用的なプロトコルを使用してこのタスクを最適化します。本書ではnerual組織でこの装置の使用は説明されています。

Abstract

神経系の中で、神経細胞およびグリア細胞の数百種類が記載されている。脳または脊髄内の各特定の細胞型は、細胞表面分子、またはそれを特定して特徴付けることができるような分子決定因子、のレパートリーを持っています。現在のところ、堅固な細胞の同定と分離技術は、同時に特徴的な表面タンパク質の細胞死と破壊を制限しながら、生成される単一セルの準備が必要です。抗原のエピトープを保持し、細胞の損失を制限しながら、トリプシンやパパインベースの解離キットと組み合わせて使用​​されるgentleMACS Dissociatorは、効果的かつ穏やかに脳組織を切り離すことができます。単一の細胞懸濁液の標準化された製剤は、Cチューブと最適化された、プリセットgentleMACSプログラムを使用して実現されます。一度生成された、単細胞懸濁液は、神経前駆細胞を識別する、またはミエリンの除去のビーズを使用してさらに精製した抗プロミニン- 1マイクロビーズのようなモノクローナルコンジュゲートで治療することができます。

Protocol

無菌条件下で動作するように、それは層流フード内のすべての手順を実行することをお勧めします。 1。材料神経組織解離キット（P）（コンポーネント：解決策1,2、3、4、記憶バッファー） プレセパレーションフィルター （オプション）ミエリンの除去ビーズ β-メルカプトエタノール gentleMACS Dissociator Cチューブ MACSmixチューブローテーター HBSS（W / O） HBSS（W） プロトコルを開始する前に以下のソリューションを準備します。 二価カチオンのないハンクスバッファード塩類溶液のCa 2 +又はMg 2 +（HBSS（W / O） HBSS、標準、すなわちカルシウム2 +およびMg 2 +（HBSS（W） その後のアプリケーションへの関心の抗原エピトープに応じて、パパインベースの神経組織解離キット（P）またはトリプシンベースの神経組織解離キット（T）のどちらかを使用してください。 神経組織解離キットから次の解決策を準備します。 解決策2：0.067 mMのβ-メルカプトエタノールを加えるソリューション4：0.7 mlの記憶バッファー（キットに付属）で粉体を溶解、静かに（ボルテックスしないでください）​​ミックス酵素ミックス1：Cチューブと10〜15分間インキュベートピペット1.9mLの溶液2と50μlの溶液1（キットからの両方）で37℃これは、脳組織の400mgを解離するのに十分です。 2。神経組織を解離 1 mlのHBSSを（W / O）を含むチューブで脳組織を秤量予熱酵素ミックス1 1950μLを含むCチューブにマウスの脳を転送する。 （注：このプロトコルは≤400 mgのために書かれていますが、ソリューションのボリュームがCチューブあたりの脳組織の1600 mgまで対応するようにスケーリングすることができます） gentleMACSのDissociatorと、実行プログラム"m_brain_01"にCチューブを置きます。 37℃で15分間回転（MACSmixチューブローテーターを用いて、4回転）でインキュベート℃に gentleMACSのDissociatorと、実行プログラム"m_brain_02"にCチューブを置きます。 解離のステップの間に静かに解決策3とソリューション4を10μl20μlを混合することによって組織の400 mg当たりの酵素ミックス2の30μlを用意する。 セプタムシールキャップを介してCチューブに酵素ミックス2を添加し、ボルテックスすることなく静かに混ぜる。 37℃で10分間回転でCチューブをインキュベートしますインキュベーターでC。 gentleMACSのDissociatorと、実行プログラム"m_brain_03"にCチューブを置きます。 37℃で10分間回転でCチューブをインキュベートしますインキュベーターでC。 チューブの下部に表示されているサンプルを収集するためにスピンダウンする。 3。ろ過目的の細胞への通過を許可するフィルタが十分な大きさを選択します。例えば、プルキンエ細胞が30μmのフィルターを通過するには大きすぎるが、プロミニン- 1 +細胞はなります。 細胞を除去するsuitable1000μlをピペットを使用するには、セプタムシールキャップを介してCチューブを形成し、15 mlのコレクションチューブにプレセパレーションフィルターに適用します。 （注：より大きなサンプルサイズが50 mlのコレクションチューブを使用するため）。 HBSS（w）の10mlでフィルターを洗浄してください。 室温で10分間、300 xgでフィルタリングされた細胞を遠心分離します。 その後のアプリケーションのための選択のあなたの培地または緩衝液の上澄みを再懸濁します。 ミエリンの残骸を削除するには、ミエリンの除去のビーズを使用してください。 4。代表的な結果：図1-3を参照してください 図。 gentleMACS Dissociatorと1脳の解離は、フローサイトメトリー解析で示すように、97％生存細胞をもたらした。 図。ニューロスフェア形成の2ライト顕微鏡画像は、磁気細胞選別後MACSでの栽培の7日後に抗プロミニン- 1 MicroBeadsを使用して® NeuroMediumはMACSサプリメントB27 PLUSで補足。細胞は、神経組織解離キット（P）を使用して、CD1マウスの脳（P3）から調製した。 図。単細胞懸濁液の3ミエリンの破片は、かなりの細胞分離を損なう、とミエリンの除去ビーズによるミエリン破片の除去は、効率の細胞分離を向上させます。抗プロミニン- 1 MicroBeadsを用いてMACS分離のために、P22マウス脳では神経組織解離キット（P）を用いて解離。単一細胞の懸濁液からの細胞を直接分離のために使用された、またはミエリン削除ビーズを使用して枯渇してミエリンに提出された。ミエリンの除去なしとの試料からの分離を比較すると、純度が以前のミエリンの除去と試料のために高いことを示しています。

Discussion

gentleMACS Dissociatorは閉鎖系での神経組織から単細胞懸濁液の標準化の準備を容易にします。神経組織の解離のキットはimmunostainingsと免疫磁気細胞分離^1から5のような、さらにアプリケーションに必要な抗原のエピトープを保持するために最適化されています。このプロトコルでは、97％生存細胞に降伏、gentleMACS Dissociatorと神経組織解離キット（P）を使用してマウスの脳の穏やかな酵素的解離を示す。宿主組織の年齢に応じて、5 × 10 ⁶と1 × 10 ⁷細胞、間に神経組織の収量100 mgの。標的プロミニン- 1 ⁺細胞は、抗プロミニン- 1 MicroBeadsを用いて単離し、その後、文化に取り込まれた。プロトコルは、マウス> P7由来の神経組織で作業するときミエリン除去ビーズの追加使用でさらに効果的であることが示されている。

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
C Tubes		Miltenyi Biotec	Order no. 130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
gentleMACS™ Starting Kit		Miltenyi Biotec	Order no. 130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator		Miltenyi Biotec	Order no. 130-090-753	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
Neural Tissue Dissociation Kit (P)		Miltenyi Biotec	Order no. 130-092-628	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Pre-Separation Filters		Miltenyi Biotec	Order no. 130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
Anti-Prominin-1 MicroBeads		Miltenyi Biotec	Order no. 130-092-333	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx
Anti-Prominin-1-APC		Miltenyi Biotec	Order no. 130-092-335	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx
Myelin Removal Beads		Miltenyi Biotec	Order no. 130-094-544	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips		Molecular BioProducts	Order no. 2079	http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61 http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html
Neural Tissue Dissociation Kit (T)		Miltenyi Biotec	Order no. 130-093-231	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Propidium Iodide Solution		Miltenyi Biotec	Order no. 130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx