אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים
Summary
בקנה מידה גדול immunodetection של חלבונים יעד ברחבי המוח הפרימטים כולו ניתן על ידי העסקת רקמה רומן הטבעה וכן חתך שיטות בשילוב עם השימוש במנגנון יצירתיים מכתים אצווה של ריחוף ללא מקטעים מרובים בכל זמן נתון.
Abstract
אימונוהיסטוכימיה (IHC) הוא אחד טכניקות מעבדה הנפוצה ביותר לצורך זיהוי של חלבונים היעד<em> באתרו</em>. שאלות בנוגע דפוס הביטוי של חלבון מטרה ברחבי המוח כולו קל יחסית לענות בעת שימוש IHC במוח קטן, כמו אלה של מכרסמים. עם זאת, לענות על אותן שאלות במוח גדול ומסורבל, כמו אלה של פרימטים מציג מספר אתגרים. כאן אנו מציגים גישה שיטתית עבור immunodetection של חלבונים היעד במוח קוף בוגר. גישה זו מסתמכת על הרקמה הטבעה וכן חתך מתודולוגיה of Neuroscience Associates (NSA), כמו גם כלים שפותחו במיוחד עבור מכתים אצווה של ריחוף ללא סעיפים. התוצאה היא מכתים אחידה של קבוצה של סעיפים אשר, במרווח מסוים, מייצג את המוח כולו. סעיפים מוכתם וכתוצאה מכך יכולה להיות נתונה למגוון רחב של נהלים אנליטיים על מנת למדוד את רמות החלבון, אוכלוסיית נוירונים לבטא חלבון מסוים.
Protocol
Discussion
ישנם שני שלבים קריטיים בהליך זה שהופכים בקנה מידה גדול זיהוי של חלבונים במוח הקוף כל האפשר. האחד הוא פרוטוקול הטבעה ואת חתך, אשר נשאר הידע הקנייני של NSA. השני הוא השימוש של מנות מכתים וסלים מסופק על ידי HistoTools. זו האחרונה מאפשרת טיפול קל ומהיר של (~ 40) קטעים רבים בזמן נתון….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים פרנק ארווין, רוברטה Palmour ואנשי מדעי ההתנהגות קרן מעבדות ממוקם בסנט קיטס, הודו המערבית, על המשך התמיכה עבודתם הפרימטים שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של X השביר קרן המחקר של קנדה (FXRFC) כדי SZ ו – מענקים ההפעלה המכונים הקנדי לבריאות מחקר (AC) ועל הנדסת הלאומי מועצת המחקר של קנדה (MP).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. | |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon | MAB377 | N/A | |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A | |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A | |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL | |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | ||
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg | |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm | |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
|
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A | |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
Riferimenti
- Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. . Guide to the Care and Use of Experimental Animals. , (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
