A imunocoloração lote de Grande Escala da detecção de proteínas no cérebro do macaco inteiro
Summary
Grande escala imunodetecção de proteínas-alvo em todo o cérebro dos primatas é possível através do emprego de tecido romance incorporação e secção métodos combinados com o uso de aparelhos criativas para a coloração de vários lotes de livre flutuação seções em um determinado momento.
Abstract
Imuno-histoquímica (IHQ) é uma das técnicas de laboratório mais amplamente utilizado para a detecção de proteínas-alvo<em> In situ</em>. Questões relativas ao padrão de expressão de uma proteína-alvo em todo o cérebro é relativamente fácil de responder ao usar IHC em cérebros pequenos, como os dos roedores. No entanto, responder às mesmas perguntas no cérebro grande e complicado, como as dos primatas apresenta uma série de desafios. Aqui nós apresentamos uma abordagem sistemática para imunodetecção de proteínas-alvo em um cérebro de macaco adulto. Esta abordagem baseia-se no tecido de incorporação e secção metodologia da neurociência Associates (NSA), bem como ferramentas desenvolvidas especificamente para o lote coloração de livre flutuação seções. Isso resulta em coloração uniforme de um conjunto de seções que, em um intervalo particular, representa todo o cérebro. As seções resultando manchado pode ser submetido a uma ampla variedade de procedimentos analíticos, a fim de medir os níveis de proteína, a população de neurônios expressando uma determinada proteína.
Protocol
Discussion
Existem dois passos críticos a este procedimento que fazer em larga escala de detecção de proteínas em um cérebro de macaco inteiro possível. Um deles é o protocolo de incorporação e de corte, que continua a ser o conhecimento de propriedade da NSA. A outra é a utilização de antenas de coloração e cestas fornecidas pelo HistoTools. Este último permite fácil manuseio e rápida de muitos (~ 40) seções em um determinado momento. Ele também fornece os meios para tratar uniformemente todas as seções em t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Frank Ervin, Palmour Roberta e do pessoal das Ciências do Comportamento da Fundação Laboratories localizado em São Cristóvão, West Indies, por seu apoio contínuo do nosso trabalho de primatas. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de Fragile X Research Foundation of Canada (FXRFC) para SZ e – subvenções de funcionamento a partir do Canadian Institutes of Health Research (AC) eo Nacional de Engenharia e Research Council of Canada (MP).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| anti-FMRP monoclonal antibody | Chemicon | MAB2160 | Requires antigen retrieval in fixed tissue. | |
| anti-NeuN monoclonal antibody | Chemicon | MAB377 | N/A | |
| anti-Neurofilament H monoclonal antibody | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/A | |
| Antigen Unmasking Solution | Vector Laboratories | H-3300 | N/A | |
| Normal horse serum | Invitrogen | 16050122 | 500 mL | |
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in horse | Vector Laboratories | BA-2000 | ||
| VECTASTAIN ABC Kit (Standard) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1.5 mg | |
| Staining dish for floating sections | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm | |
| Staining transport basket | HistoTools | 10012 | large (fits 12 x 65 mm dish) |
|
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/A | |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/A |
Riferimenti
- Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. . Guide to the Care and Use of Experimental Animals. , (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
