成体ラットの心筋細胞の初代培養

Summary

本稿では、成体ラットの心筋細胞を分離、培養に一般的な方法を説明した。コラゲナーゼとプロテアーゼは、単一の心筋細胞を消化して単離するために使用されています。心筋細胞は、ほとんどの実験の要件を満たすこのプロトコルに従って培養した。

Abstract

培養一次成人の齧歯類の心臓の細胞は、心臓血管研究のための重要なモデル系である。それにもかかわらず、堅牢な、実行可能な培養成人心筋細胞の確立は、多くの研究者のための技術的に困難な、律速段階であることができる。ここでは、数日間培養中で実行可能なまま成体ラットの心筋細胞の高い収量を得るためのプロトコルを説明した。心臓は、低Caで単離され、コラゲナーゼやプロテアーゼで灌流され^{2 +}条件は、単一の筋細胞を回復する。のCa^{2 +}耐性細胞は、細胞外Caで段階的に増加することによって得られる<sup> 2 +</sup以降3回の洗浄ステップで>集中。細胞を濾過し、培養培地中に再懸濁し、ラミニンコートしたガラス上でメッキされています。このプロトコルを使用して得られた培養心筋細胞では最長4日間生存可能と電気生理学、生化学、イメージングと分子生物学を含むほとんどの実験に適しています。

Protocol

手術のためのパートI.準備ラットの手術の前日は、すべてのソリューションが行われていることを確認して、まだどの酵素を追加しないでください。バッファ、Bおよび洗浄緩衝液は、すべてのストレージの前に無菌のためにフィルタリングする必要があります。バッファはすべて4℃で保存してください。 6ウェル組織培養プレートを10〜20μgの/ 2mLの1XSFM mLのラミニンと同様前日…

Discussion

重要なステップは、単離心臓を灌流システム上でハングアップされる速度です。酵素消化の期間の長さは、各ラットのために少し異なる場合があります。調整は、心臓、消化の定期的な期間の後になるとどのようにソフトに依存します。酵素消化後のCa ²徐々に回復^{+は、Ca 2 +}トレラント健康な細胞を得るために不可欠です。

モルモットの場合、プロトコ?…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
NaCl		Sigma	S6191
KCl		Sigma	P9541
HEPES		Sigma	H4034
K2HPO4		Sigma	P9666
MgSO4		Fluka	63068
Glucose		Sigma	G7021
CaCl2		Sigma	C7902
Heparin Sodium Salt		Sigma	H4784
Collagenase Type II		Worthington Biochemical	LS004176
Protease XIV		Sigma	P5147
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)		Sigma	B0753
Carnitine		Sigma	C9500
Taurine		Sigma	T0625
Glutamic Acid		Sigma	G1501
BSA		Sigma	A3294
Creatine		Sigma	C3630
Antibiotic		Cellgro	30-009-CI
Media 199		GIBCO	11150
FBS		Hyclone	SH30071.03
Laminin		BD Bioscience	354232
water bath		Fisher Scientific	15-462-5
variable flow chemical pump		Fisher Scientific	15-077-67
6-well culture plate		Corning	3516