Imaging cellulare dal vivo di F-actina Dynamics tramite microscopia a fluorescenza Speckle (FSM)
Summary
Selezione, microiniezione, e l'imaging di fluorescenza marcata con F-actina tramite microscopia a fluorescenza speckle (FSM).
Abstract
In questo protocollo si descrivono l'uso della microscopia a fluorescenza Speckle (FSM) di catturare immagini ad alta risoluzione delle dinamiche di actina in cellule PtK1. Un vantaggio unico del FSM è la sua capacità di catturare il movimento e la cinetica fatturato (montaggio / smontaggio) della F-actina rete all'interno delle cellule viventi. Questa tecnica è particolarmente utile nel derivare misurazioni quantitative di F-actina dinamiche se abbinato con il software di visione artificiale (qFSM). Descriviamo la, microiniezione selezione e la visualizzazione di sonde fluorescenti actina in cellule viventi. È importante sottolineare che le procedure siano applicabili alla visualizzazione assemblee macomolecular altri. FSM è stata dimostrata per microtubuli, filamenti intermedi, e complessi di adesione.
Protocol
Discussion
Diversi sono i fattori chiave fondamentale per riuscire a ottenere immagini speckle, per quanto buone macchioline iniziano e terminano con la qualità della vostra actina fluorescente. Un rapporto di etichettatura elevati di colorante di actina monomero, disposti intorno a 0,4-0,7 farà in modo che puntini apparirà luminoso e discreto, mentre la proteina etichettata stesso dovrebbe essere solubile e priva di aggregati. Altrettanto importante è la procedura di microiniezione. Per assicurare la normale omeostasi cellula…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo sviluppo di qFSM è finanziato dalla sovvenzione NIH U01 GM06230.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
Riferimenti
- Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305, 1782-1786 (2004).
- Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow. Neuron. 40, 931-944 (2003).
- Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).
