F - actin的动力学通过荧光活细胞成像斑点显微镜（密克罗尼西亚）
Summary
的选择，显微注射，并成像荧光标记的F -肌动蛋白，通过荧光斑点显微镜（密克罗尼西亚）。
Abstract
在这个协议中，我们描述了使用荧光斑点显微镜（FSM）来捕获PtK1细胞的肌动蛋白动力学的高清晰度图像。密克罗尼西亚的一个独特的优势是它能够捕捉到活细胞内的流动和周转动力学的F -肌动蛋白网络（组装/拆卸）。这种技术是有用的，特别是在衍生F -肌动蛋白动力学的定量测量与计算机视觉软件（qFSM）配对。我们描述了选择，显微注射法和荧光的肌动蛋白探针在活细胞中的可视化。更重要的是，类似的程序，适用于可视化等macomolecular集会。密克罗尼西亚已经证明微管，中间丝和粘附复合物。
Protocol
Discussion
几个关键因素是至关重要的，成功获得散斑图像，但是良好的斑点，开始和结束与荧光标记的肌动蛋白的质量。一个标签的比例高，肌动蛋白单体，约0.4至0.7的染料将确保斑点会显得明亮和离散，标记的蛋白质本身，而应可溶性聚集。同样重要的是显微注射过程。为了保证正常细胞动态平衡和生存，细胞需要被注入一个低流量的压力，引入低浓度的标记蛋白。这需要一定的技术专业知识/经验的显…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
由美国国立卫生研究院授予U01 GM06230 qFSM发展。
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
Riferimenti
- Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305, 1782-1786 (2004).
- Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow. Neuron. 40, 931-944 (2003).
- Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).
