דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)
Summary
, מבחר microinjection, הדמיה של fluorescently שכותרתו F-אקטין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רבב (FSM).
Abstract
בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM) כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה של אקטין הדינמיקה PtK1 תאים. היתרון הייחודי של FSM היא יכולתו ללכוד את התנועה קינטיקה מחזור (הרכבה / פירוק) של רשת ה-F-אקטין בתוך תאים חיים. טכניקה זו שימושית במיוחד הנובעות מדידות כמותית של ה-F-אקטין הדינמיקה כאשר יחד עם תוכנה ראייה ממוחשבת (qFSM). אנו מתארים את, מבחר microinjection ויזואליזציה של בדיקות אקטין פלואורסצנטי בתאים חיים. חשוב לציין, נהלים דומים החלים חזותי macomolecular מכלולים אחרים. FSM הוכח עבור microtubules, חוטים ביניים מתחמי הידבקות.
Protocol
Discussion
גורמים מרכזיים הם קריטיים עבור קבלת בהצלחה רבב תמונות, speckles טוב אבל להתחיל ולסיים עם איכות של אקטין שכותרתו fluorescently שלך. יחס גבוה של תיוג צבען מונומר אקטין, להגדיר סביב 0.4-0.7 תבטיח speckles יופיעו בהיר בדידה, ואילו חלבון הנקרא עצמו צריך להיות מסיסים חינם של אגרגטים. לא פחות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפיתוח של qFSM ממומן על ידי מענק NIH U01 GM06230.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
References
- Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305, 1782-1786 (2004).
- Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow. Neuron. 40, 931-944 (2003).
- Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).
