蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）
Summary
選択、マイクロインジェクション、および蛍光を経由して蛍光標識F -アクチンのイメージング顕微鏡（FSM）のスペック。
Abstract
このプロトコルでは、蛍光の使用を説明しPtK1細胞におけるアクチンダイナミクスの高解像度の画像をキャプチャするために顕微鏡（FSM）のスペック。 FSMのユニークな利点は、生きた細胞内でF -アクチンのネットワークの移動と回転率の動態（組立/分解）をキャプチャする機能です。この手法は、コンピュータビジョンのソフトウェア（qFSM）と組み合わせた場合、F -アクチンのダイナミクスの定量的な測定値を導出する場合に特に便利です。我々は生きた細胞内の蛍光アクチンプローブの選択、マイクロインジェクションおよび視覚化について説明します。重要なことは、同様の手順では、他のmacomolecularアセンブリの可視化に適用可能である。 FSMは、微小管、中間径フィラメント、及び接着複合体のために実証されている。
Protocol
Discussion
いくつかの重要な要素が正常に画像のスペックル得るために不可欠な、しかし良い斑点が開始して、蛍光標識アクチンの品質で終了。標識タンパク質自体が水溶性と凝集体の自由でなければならないしながら0.4から0.7の周りに設定されたアクチン単量体への染料の高いラベリングの比率は、、斑点が明るいと離散的に表示されるようになります。同様に重要なマイクロインジェクションの手?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
qFSMの開発は、NIHの助成金U01 GM06230によって運営されている。
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
References
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