Microinjeção de seleção, e as imagens de fluorescência marcado com F-actina através de microscopia fluorescente speckle (FSM).
Abstract
Neste protocolo, descrevemos o uso de Microscopia fluorescente Speckle (FSM) para capturar imagens de alta resolução de actina na dinâmica PtK1 células. A única vantagem do FSM é sua capacidade de captar o movimento e cinética volume de negócios (montagem / desmontagem) da rede de F-actina dentro de células vivas. Esta técnica é particularmente útil em derivar medidas quantitativas de F-actina dinâmica quando emparelhado com o computador de software de visão (qFSM). Descrevemos a seleção microinjeção, e visualização de sondas fluorescentes de actina em células vivas. Importante, procedimentos semelhantes são aplicáveis a visualizar conjuntos macomolecular outros. FSM tem sido demonstrado por microtúbulos, filamentos intermediários, e os complexos de adesão.
Protocol
Seção 1: Obtenção do seu actina fluorescente etiquetado para FSM Materiais necessários: purificada actina, fluoróforo (Alexa, X-rodamina recomendado). G-buffer, ultracentrífuga Um componente chave para a aquisição de filmes FSM boa exige a rotulagem adequada de actina (ou outras proteínas do citoesqueleto) com o fluoróforo de sua escolha. Recomendamos o uso de fluoróforos Alexa (488, 568 comprimentos de onda) e X-rodamina derivados de éster succinimidyl que a m…
Discussion
Vários fatores importantes são cruciais para o êxito da obtenção de imagens speckle, manchas no entanto bom começar e terminar com a qualidade do seu actina fluorescente etiquetado. A relação de rotulagem elevado de tintura para actina monômero, situado em torno de 0,4-,7 irá garantir que os salpicos aparecerá brilhante e discreta, enquanto a proteína em si deve ser rotulado solúvel e livre de agregados. Igualmente importante é o procedimento de microinjeção. Para garantir a homeostase celular normal (e …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O desenvolvimento de qFSM é financiado pelo NIH a concessão U01 GM06230.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325, doi:10.3791/1325 (2009).