Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)
Summary
Urval, mikroinjektion och avbildning av fluorescerande-märkta F-aktin via fluorescerande speckle mikroskopi (FSM).
Abstract
I detta protokoll beskriver vi användning av fluorescerande Speckle mikroskopi (FSM) för att ta högupplösta bilder av aktin dynamik i PtK1 celler. En unik fördel med Mikronesiens är dess förmåga att fånga rörelsen och kinetik omsättning (montering / demontering) av F-aktin nätverk inom levande celler. Denna teknik är särskilt användbart med att dra kvantitativa mätningar av F-aktin dynamik när det paras ihop med datorseende programvara (qFSM). Vi beskriver valet, mikroinjektion och visualisering av fluorescerande aktin sonder i levande celler. Viktigt liknande förfaranden gäller för visualisera andra macomolecular församlingar. FSM har visats för mikrotubuli, intermediära filament och komplex vidhäftning.
Protocol
Discussion
Flera viktiga faktorer är avgörande för att lyckas få speckle bilder, hur bra prickar börjar och slutar med kvaliteten på din fluorescerande aktin. En hög märkning förhållande färgämne till aktin monomer, ligger runt 0,4 till 0,7 kommer att säkerställa att fläckarna kommer att visas ljusa och diskreta, medan de märkta proteinet i sig bör vara lösliga och fri från aggregat. Lika viktigt är mikroinjektion förfarande. För att säkerställa normal cell homeostas (och överlevnad), celler måste injicer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Utvecklingen av qFSM finansieras av NIH bidraget U01 GM06230.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
References
- Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305, 1782-1786 (2004).
- Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow. Neuron. 40, 931-944 (2003).
- Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).
