Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)
Summary
Selection, Mikroinjektion, und Bildgebung von fluoreszenzmarkierten F-Aktin über fluoreszierende Speckle-Mikroskopie (FSM).
Abstract
In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Speckle Microscopy (FSM), um hochauflösende Bilder der Aktindynamik in PtK1 Zellen zu erfassen. Ein einzigartiger Vorteil der FSM ist seine Fähigkeit, die Bewegung und Umsatz Kinetik (Montage / Demontage) der F-Aktin-Netzwerk innerhalb lebender Zellen zu erfassen. Diese Technik ist besonders nützlich bei der Ermittlung quantitativer Messungen von F-Aktin-Dynamik, wenn sie mit Computer-Vision-Software (qFSM) gepaart. Wir beschreiben die Auswahl, die Mikroinjektion und Visualisierung von Fluoreszenz-Aktin-Sonden in lebenden Zellen. Wichtig ist, dass ähnliche Verfahren für die Visualisierung von anderen macomolecular Baugruppen. FSM hat für Mikrotubuli, Intermediärfilamente und Haftung Komplexe nachgewiesen.
Protocol
Discussion
Mehrere wichtige Faktoren sind entscheidend für die erfolgreiche Bilder Speckle erhalten, beginnen aber gute Speckles und enden mit der Qualität Ihrer fluoreszenzmarkierten Aktin. Ein hoher Kennzeichnung von Farbstoff an Aktin-Monomer, um 0,4 bis 0,7 eingestellt wird sichergestellt, dass Flecken erscheinen hell und diskret, während das markierte Protein selbst sollte löslich und frei von Aggregaten. Ebenso wichtig ist die Mikroinjektion Verfahren. Um normalen Zell-Homöostase (und Überleben), müssen Zellen mit ein…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Entwicklung der qFSM wird durch die NIH U01 GM06230 finanziert.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
Riferimenti
- Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305, 1782-1786 (2004).
- Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow. Neuron. 40, 931-944 (2003).
- Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).
