从0.22微米Sterivex过滤器和氯化铯密度梯度离心法的DNA提取
Summary
我们描述了一个超高分子量从浮游生物的生物量基因组集中Sterivex 0.22微米的过滤器，氯化铯密度梯度离心纯化的DNA提取方法。
Abstract
这种方法是使用0.22微米Sterivex已存储/裂解液治疗，并存档于-80 ° C过滤器浮游生物质集中超高分子量基因组DNA提取和净化使用氯化铯密度梯度，这种DNA。该协议开始有两个小时的孵化步骤，从细胞中解放出来的DNA和删除的RNA。接下来，进行一系列的酚：氯仿和氯仿抽提随后通过离心去除蛋白质和细胞膜的成分，收集水的DNA提取液，清洗和集中提取的几个缓冲交换步骤。第五部分介绍了通过氯化铯密度梯度可选净化。建议工作在同一时间少于15个样品，以避免混乱和削减协议的时间。本议定书所需的总时间取决于要提取的样品的数量。 10-15个样本，并假设适当的离心设备，整个协议应采取3天。确保你有杂交的过程开始时设置温度的烤炉。
Protocol
注：在本议定书中所使用的所有试剂是从实验室股票分装成较小的工作库存，这是非常重要的，以避免交叉污染你的DNA样本和实验室股市污染。 此外，移液时，一定要改变每此外，避免交叉污染移液器。 第一部分：细胞裂解和消化开始融化的冰包含以前集中的浮游生物质Sterivex过滤器本议定书。为了简单起见，这里我们描述的程序，用于处?…
Discussion
根据要处理多少样本，这可能是一个时间密集型的过程，由于两个小时的孵化步骤，和反复洗涤，离心步骤。这是最好的计划，此过程整整两天，留下充裕的时间。如果有问题Amicon管最终提取量减少了200 -500μL，在DNA的浓度和洗涤，尝试做更多的TE清洗和离心（重复第三部分），直到合适的音量是吃剩的。此外，如果敏锐的氯仿提取物的气味，这是最好做额外的清洗，直到气味减轻，以确保所…
Acknowledgements
我们要感谢支持沿海和公海水域低氧气地区正在进行的研究创新，不列颠哥伦比亚省知识发展基金和国家科学和工程研究理事会（NSERC），加拿大的加拿大基金会。 JJW是由NSERC和DAW奖学金的支持是由NSERC，Killam和图拉基金会资助的微生物多样性和进化中心奖学金的支持。 SL是由微生物多样性和进化图拉基金会资助中心的支持。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | ||
| 15ml tubes | Sigma | CLS430791 | ||
| 5cc syringe | BD | 309603 | ||
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit | |
| Butanol | Fisher | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) | |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter | 368690 | ||
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter | 369003 | ||
| Cesium chloride | Sigma | C4036 | ||
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma | 25666-500ML | ||
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma | E1510-10ml | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma | E5134 | ||
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C | |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | |||
| Lysozyme | Sigma | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE | |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | 50 bp cut off | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | ||
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma | 77617-500ML | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| RNase A | Fisher | BP2539-100 | 10 μg/ml | |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L4509 | 20% SDS | |
| Sterivex filters | Fisher | SVG010RS | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| TE buffer, pH 8.0 | ||||
| Trizma® base | Sigma | T1503 | ||
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter | 343847 | ||
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman | 343775 | ||
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman | 348302 | ||
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter |
Riferimenti
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
Tags
DNA ExtractionHigh Molecular Weight Genomic DNAPlanktonic BiomassSterivex FiltersStorage/lysis Buffer-80°C StorageCesium Chloride Density Gradient CentrifugationIncubation StepsLiberate DNARemove RNAPhenol:Chloroform ExtractionChloroform ExtractionCentrifugationProtein RemovalCell Membrane RemovalAqueous DNA ExtractBuffer ExchangePurificationCesium Chloride Density GradientSample LimitationProtocol TimeCentrifugation EquipmentHybridization Ovens
Citazione di questo articolo
Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (31), e1352, doi:10.3791/1352 (2009).