DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie
Summary
We beschrijven een methode voor de extractie van een hoog moleculair gewicht genomische DNA van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 micrometer Sterivex filters, gevolgd door een cesium chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie voor zuivering.
Abstract
Deze methode wordt gebruikt om een hoog moleculair gewicht genomische DNA-extract van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 uM Sterivex filters die zijn behandeld met opslag / lysisbuffer en gearchiveerd bij -80 ° C, en dit met behulp van DNA een cesium chloride dichtheidsgradiënt te zuiveren. Het protocol begint met twee een-uur incubatie stappen om DNA te bevrijden van cellen en te verwijderen RNA. Vervolgens wordt een reeks van Fenol: zijn Chloroform Chloroform en extracties uitgevoerd, gevolgd door centrifugeren aan eiwitten en celmembraan componenten, collectie van het waterige DNA-extract, en een aantal buffer uitwisseling stappen te wassen en te concentreren het extract te verwijderen. Deel vijf beschrijft de optionele zuivering via cesium chloride dichtheidsgradiënt. Het wordt aanbevolen om met minder dan 15 monsters te werken in een keer om verwarring te voorkomen en te bezuinigen protocol tijd. De totale tijd die nodig is voor dit protocol is afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden geëxtraheerd. Voor 10-15 monsters en ervan uitgaande dat de juiste centrifugeren apparatuur beschikbaar is, moet deze hele protocol duurt 3 dagen. Zorg ervoor dat u de hybridisatie ovens ingesteld op de temperatuur aan het begin van het proces.
Protocol
Discussion
Afhankelijk van het aantal monsters dienen te worden verwerkt, kan dit een tijdrovende procedure als gevolg van de twee een uur incubatie stappen, en de herhaalde wast en centrifugeren stappen. Het beste is om twee hele dagen voor deze procedure van plan om veel tijd te verlaten. Als er problemen zijn het krijgen van het uiteindelijke extract volume in de Amicon buis naar beneden te reduceren tot 200-500μl tijdens de DNA-concentratie en het wassen, probeer dan extra TE wast en centrifugations (herhaling deel drie) tot …
Acknowledgements
We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds en de National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada te bedanken voor de ondersteuning van lopende studies op een laag zuurstofgehalte regio's van kust-en open water van de oceaan. JJW werd ondersteund door beurzen uit NSERC en DAW werd ondersteund door beurzen uit NSERC, Killam en de TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie. SL werd gesteund door de stichting gefinancierd TULA Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | ||
| 15ml tubes | Sigma | CLS430791 | ||
| 5cc syringe | BD | 309603 | ||
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit | |
| Butanol | Fisher | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) | |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter | 368690 | ||
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter | 369003 | ||
| Cesium chloride | Sigma | C4036 | ||
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma | 25666-500ML | ||
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma | E1510-10ml | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma | E5134 | ||
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C | |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | |||
| Lysozyme | Sigma | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE | |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | 50 bp cut off | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | ||
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma | 77617-500ML | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| RNase A | Fisher | BP2539-100 | 10 μg/ml | |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L4509 | 20% SDS | |
| Sterivex filters | Fisher | SVG010RS | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| TE buffer, pH 8.0 | ||||
| Trizma® base | Sigma | T1503 | ||
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter | 343847 | ||
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman | 343775 | ||
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman | 348302 | ||
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter |
Riferimenti
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
