הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient
Summary
אנו מתארים שיטה להפקת גבוה הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex, ואחריו צפיפות צזיום כלוריד צנטריפוגה שיפוע לטיהור.
Abstract
שיטה זו משמשת כדי לחלץ DNA גנומי מולקולרי גבוה משקל מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex כי טופלו למאגר אחסון / תמוגה לארכיון ב -80 ° C, כדי לטהר את ה-DNA באמצעות שיפוע צפיפות צזיום כלוריד. פרוטוקול מתחיל עם שני שעה צעדים הדגירה לשחרר את ה-DNA מתאי ולהסיר RNA. בשלב הבא, בסדרה של פנול: כלורופורם ו כלורופורם עקירות מבוצעות ואחריו צנטריפוגה להסיר חלבונים בממברנה מרכיבי התא, אוסף של תמצית ה-DNA מימית, וכמה חילופי חיץ צעדים כדי לרחוץ לרכז את תמצית. חלק חמישי מתאר את טיהור אופציונלי באמצעות שיפוע צזיום כלוריד צפיפות. מומלץ לעבוד עם פחות מ 15 דגימות בעת ובעונה אחת, כדי למנוע בלבול ולכרות זמן פרוטוקול. סך כל הזמן הנדרש פרוטוקול זה תלוי במספר דגימות להיעקר. במשך 10-15 דגימות בהנחה צנטריפוגה ציוד מתאים זמין, בפרוטוקול זה כולה צריכה לקחת 3 ימים. ודא שיש לך את התנורים הכלאה מוגדר הטמפרטורה בתחילת התהליך.
Protocol
Discussion
תלוי כמה דוגמאות רבות להיות מעובד, זה יכול להיות הליך הזמן אינטנסיבית בשל שני צעדים הדגירה של שעה אחת, ואת שוטף חוזרות צעדים צנטריפוגה. עדיף לתכנן יומיים שלמים לצורך הליך זה להשאיר הרבה זמן. אם יש בעיות מקבל את נפח לחלץ הסופי בצינור Amicon להפחית עד 200 500μl במהלך ריכוז דנ&quo…
Acknowledgements
ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, פיתוח קולומביה הבריטית קרן ידע מדעי הלאומי וההנדסה מועצת המחקר (NSERC) של קנדה לתמיכה מחקרים מתמשכים על אזורים חמצן נמוכה של מים חופי האוקיינוס הפתוח. JJW נתמכה על ידי מלגות של NSERC ו דאו נתמכה על ידי מלגות של NSERC, Killam ויסוד טולה מרכז מימנה עבור גיוון התפתחות חיידקים. SL נתמכה על ידי המרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | ||
| 15ml tubes | Sigma | CLS430791 | ||
| 5cc syringe | BD | 309603 | ||
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit | |
| Butanol | Fisher | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) | |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter | 368690 | ||
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter | 369003 | ||
| Cesium chloride | Sigma | C4036 | ||
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma | 25666-500ML | ||
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma | E1510-10ml | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma | E5134 | ||
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C | |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | |||
| Lysozyme | Sigma | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE | |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | 50 bp cut off | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | ||
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma | 77617-500ML | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| RNase A | Fisher | BP2539-100 | 10 μg/ml | |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L4509 | 20% SDS | |
| Sterivex filters | Fisher | SVG010RS | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| TE buffer, pH 8.0 | ||||
| Trizma® base | Sigma | T1503 | ||
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter | 343847 | ||
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman | 343775 | ||
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman | 348302 | ||
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter |
Riferimenti
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
