0.22 सुक्ष्ममापी Sterivex फ़िल्टर और सीज़ियम क्लोराइड घनत्व ढाल centrifugation से डीएनए निष्कर्षण
Summary
हम उच्च planktonic बायोमास से आणविक भार जीनोमिक डीएनए 0.22 सुक्ष्ममापी Sterivex फिल्टर, सीज़ियम शुद्धि के लिए क्लोराइड घनत्व ढाल centrifugation द्वारा पीछा किया पर ध्यान केंद्रित की निकासी के लिए एक विधि का वर्णन.
Abstract
इस विधि planktonic 0.22 सुक्ष्ममापी Sterivex फिल्टर है कि भंडारण / lysis बफर के साथ इलाज किया गया है और -80 ° सी में संग्रहीत पर केंद्रित बायोमास से उच्च आणविक भार जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए, और यह एक सीज़ियम क्लोराइड घनत्व ढाल का उपयोग डीएनए शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रोटोकॉल दो एक घंटे ऊष्मायन कदम के कोशिकाओं से डीएनए आजाद कराने और आरएनए हटायें के साथ शुरू होता है. अगला, Phenol की एक श्रृंखला: क्लोरोफॉर्म और क्लोरोफॉर्म extractions centrifugation द्वारा प्रदर्शन का पालन कर रहे हैं प्रोटीन और कोशिका झिल्ली घटकों, जलीय डीएनए निकालने के संग्रह, और कई बफर विनिमय कदम को धोने और ध्यान केंद्रित निकालने निकालना. भाग पांच सीज़ियम क्लोराइड घनत्व ढाल के माध्यम से वैकल्पिक शुद्धि का वर्णन करता है. यह एक समय में कम से कम 15 नमूनों के साथ काम करने के लिए भ्रम से बचने और नीचे प्रोटोकॉल समय में कटौती की सिफारिश की है. कुल इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक समय निकाला जा नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है. 3 दिन, 10-15 नमूने और यह सोचते हैं उचित centrifugation उपकरण उपलब्ध है के लिए इस पूरे प्रोटोकॉल लेना चाहिए. सुनिश्चित करें कि आप संकरण प्रक्रिया के शुरू में तापमान करने के लिए सेट ओवन है.
Protocol
Discussion
कैसे नमूने संसाधित किया जा रहे हैं पर निर्भर करता है, यह एक समय गहन दो एक घंटे ऊष्मायन कदम, और दोहराया washes और centrifugation कदम के कारण प्रक्रिया किया जा सकता है. यह सबसे अच्छा है इस प्रक्रिया के लिए पूरे दो दिन की य?…
Acknowledgements
हम तटीय और खुले समुद्र के पानी के कम ऑक्सीजन क्षेत्रों पर चल रहे अध्ययन का समर्थन करने के लिए अभिनव, ब्रिटिश कोलंबिया नॉलेज डेवलपमेंट फंड और राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC के लिए कनाडा फाउंडेशन धन्यवाद देना चाहूंगा. JJW NSERC और काला कौवा से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया NSERC, किल्लम और तुला माइक्रोबियल विविधता और विकास के लिए वित्त पोषित केंद्र नींव से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था. SL तुला माइक्रोबियल विविधता और विकास के लिए नींव वित्त पोषित केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | ||
| 15ml tubes | Sigma | CLS430791 | ||
| 5cc syringe | BD | 309603 | ||
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit | |
| Butanol | Fisher | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) | |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter | 368690 | ||
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter | 369003 | ||
| Cesium chloride | Sigma | C4036 | ||
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma | 25666-500ML | ||
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma | E1510-10ml | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma | E5134 | ||
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C | |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | |||
| Lysozyme | Sigma | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE | |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | 50 bp cut off | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | ||
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma | 77617-500ML | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| RNase A | Fisher | BP2539-100 | 10 μg/ml | |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L4509 | 20% SDS | |
| Sterivex filters | Fisher | SVG010RS | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| TE buffer, pH 8.0 | ||||
| Trizma® base | Sigma | T1503 | ||
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter | 343847 | ||
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman | 343775 | ||
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman | 348302 | ||
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter |
Riferimenti
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
