우리는 정화를 위해 세슘 염화물 밀도 기울기 원심 분리 다음 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출을위한 방법을 설명합니다.
Abstract
이 방법은 스토리지 / 용해 버퍼를 취급하고 -80 ° C에 보관되었습니다 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈 DNA를 추출하고, 세슘 염화물 밀도 기울기를 사용하여이 DNA를 정화하는 데 사용됩니다. 프로토콜은 세포에서 DNA를 해방하고 RNA를 제거하는 방법은 두 한 시간 배양 단계를 시작합니다. 다음으로, 페놀 일련의 : 클로로포름 및 클로로포름 extractions는 단백질과 세포막의 구성 요소, 수성 DNA 추출물의 수집과 추출을 씻어하고 집중 여러 버퍼 교환 단계를 제거하기 위해 원심 분리 다음에 수행됩니다. 부품 다섯 세슘 염화물 농도 기울기를 통해 옵션 정화에 대해 설명합니다. 그것은 혼동을 피하기 및 프로토콜 시간을 줄이려고 한 번에 미만 15 샘플에서 작동하도록 권장합니다. 이 프로토콜에 필요한 총 시간은 추출되는 샘플 수에 따라 달라집니다. 10-15 샘플 및 적절한 원심 분리 장비를 사용할 수있는 가정의 경우이 모든 프로토콜 3 일이 소요됩니다. 당신은 프로세스의 초기에 온도로 설정 하이브 리다이 제이션 오븐을 가지고 있는지 확인하십시오.
Protocol
참고 :이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약이 작동 주식을이 당신의 DNA 샘플 및 연구소 주식 오염의 교차 오염을 방지하는 것이 매우 중요 작은 실험실로 주식에서 aliquoted 있습니다. 또한, pipetting 때 교차 오염을 피하기 위해 모든 외에도 위해 피펫 팁을 변경할 수 있는지 확인하십시오. 부 원 : 세포 용해와 소화 얼음 이전에 집중 planktonic의 바이?…
Discussion
처리하는 방법에 많은 샘플 아르에 따라이 두 한 시간 동안 부화 단계 및 반복 세척과 원심 분리 단계로 인해 시간이 많이 소요되는 절차하실 수 있습니다. 충분한 시간을두고이 절차에 대한 이틀 동안 계획하는 것이 좋습니다. 해당 볼륨이 남은까지 (파트 3 번 반복) 추가 TE의 세척 및 centrifugations하고 시도, DNA 농도 및 세척하는 동안 200 500μl로 줄이기 위해 Amicon 튜브의 마지막 추출 볼륨을 받고 ?…
Acknowledgements
우리는 해안과 열린 바다 바닷물의 낮은 산소 지역에 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금과 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. JJW가 NSERC와 도스의 장학금이 지원되었고 NSERC, 킬람와 툴라 기초 미생물 다양성과 진화에 대한 재정 지원 센터에서 장학금으로 지원했다. SL은 미생물 다양성과 발전을위한 기초 자금 툴라 센터에 의해 지원되었다.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
1 cc syringe (26G5/8 needle)
BD
309597
1 ml syringe (26G5/8 needle)
BD
309597
1.5ml eppendorf tubes
Eppendorf
0030 125.150
15ml tubes
Sigma
CLS430791
5cc syringe
BD
309603
Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices
Millipore
UFC801096
10,000 Nominal molecular weight limit
Butanol
Fisher
A383-1
Make it water saturated (butanol:water = 1:1)
Centrifuge rotor, JA5.3
Beckman Coulter
368690
Centrifuge, Avanti® J-E
Beckman Coulter
369003
Cesium chloride
Sigma
C4036
Chloroform:IAA (24:1)
Sigma
25666-500ML
Ethidium Bromide (EtBr)
Sigma
E1510-10ml
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate
Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (31), e1352, doi:10.3791/1352 (2009).