Extração de DNA de 0,22 mM Sterivex Filtros e Césio cloreto de centrifugação em gradiente de densidade
Summary
Nós descrevemos um método para extração de DNA genômico de alto peso molecular a partir da biomassa planctônica concentrou-se em 0,22 mM filtros Sterivex, seguido por centrifugação em gradiente de cloreto de césio densidade para purificação.
Abstract
Este método é usado para extrair o DNA genômico de alto peso molecular a partir da biomassa planctônica concentrou-se em 0,22 mM Sterivex filtros que foram tratados com armazenamento / tampão de lise e arquivados a -80 ° C, e para purificar esse DNA usando um gradiente de densidade de césio cloreto. O protocolo começa com duas etapas de uma hora de incubação para liberar o DNA das células e remover RNA. Em seguida, uma série de Fenol: Clorofórmio Clorofórmio e extrações são realizadas seguida de centrifugação para remover proteínas e componentes da membrana celular, a coleta do extrato aquoso de DNA, e as etapas de vários buffer de troca para lavar e concentrar o extrato. Parte V descreve a purificação opcional através de gradiente de cloreto de césio densidade. Recomenda-se a trabalhar com menos de 15 amostras de uma só vez para evitar confusão e reduzir o tempo de protocolo. O tempo total necessário para este protocolo depende do número de amostras a serem extraídas. Por 10-15 amostras e assumindo o equipamento de centrifugação adequada estiver disponível, este protocolo inteiro deve levar três dias. Certifique-se que os fornos de hibridação definir a temperatura no início do processo.
Protocol
Discussion
Dependendo do número de amostras devem ser processadas, isso pode ser um procedimento demorada devido aos dois passos de incubação de uma hora, e as lavagens repetidas e passos de centrifugação. É melhor plano de dois dias inteiros para este procedimento para deixar bastante tempo. Se houver problemas para obter o volume extrato final no tubo Amicon para reduzir até 200 500μl durante a concentração de DNA e de lavar roupa, tentar fazer lavagens adicionais TE e centrifugações (repetir Parte III) até que o vo…
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e das Ciências e Pesquisa de Engenharia National Council (NSERC) do Canadá para apoiar estudos em andamento em regiões de baixo oxigênio das águas oceânicas costeiras e aberto. JJW foi apoiado por bolsas de NSERC e DAW foi apoiado por bolsas de NSERC, Killam ea fundação TULA Centro financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution. SL foi apoiado pelo Centro de fundação TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | ||
| 15ml tubes | Sigma | CLS430791 | ||
| 5cc syringe | BD | 309603 | ||
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit | |
| Butanol | Fisher | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) | |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter | 368690 | ||
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter | 369003 | ||
| Cesium chloride | Sigma | C4036 | ||
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma | 25666-500ML | ||
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma | E1510-10ml | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma | E5134 | ||
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C | |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | |||
| Lysozyme | Sigma | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE | |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | 50 bp cut off | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | ||
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma | 77617-500ML | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| RNase A | Fisher | BP2539-100 | 10 μg/ml | |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L4509 | 20% SDS | |
| Sterivex filters | Fisher | SVG010RS | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| TE buffer, pH 8.0 | ||||
| Trizma® base | Sigma | T1503 | ||
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter | 343847 | ||
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman | 343775 | ||
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman | 348302 | ||
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter |
Riferimenti
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- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
