Extracción de ADN de 0,22 M Filtros Sterivex y centrifugación de densidad de cloruro de cesio Gradient
Summary
Se describe un método para la extracción de ADN de alto peso molecular genómico a partir de biomasa planctónica se concentró en 0,22 micras filtros Sterivex, seguido por centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio para la purificación.
Abstract
Este método se utiliza para extraer el ADN de alto peso molecular genómico a partir de biomasa planctónica se concentró en 0,22 M filtros Sterivex que han sido tratados con buffer de almacenamiento / lisis y archivados a -80 ° C, y para purificar el ADN utilizando un gradiente de densidad de cloruro de cesio. El protocolo se inicia con dos etapas de incubación de una hora para liberar el ADN de las células y eliminar el ARN. A continuación, una serie de fenol: cloroformo y cloroformo extracciones se llevan a cabo, seguido por centrifugación para separar las proteínas y los componentes de la membrana celular, la recolección del extracto acuoso de ADN, y varias medidas de cambio de amortiguación para el lavado y concentrar el extracto. Quinta Parte describe la purificación opcional a través de gradiente de densidad de cloruro de cesio. Se recomienda trabajar con menos de 15 muestras al mismo tiempo para evitar la confusión y reducir el tiempo de protocolo. El tiempo total requerido para este protocolo depende del número de muestras que se extraen. De 10 a 15 muestras y suponiendo que el equipo de centrifugación adecuada está disponible, este protocolo completo debe tomar 3 días. Asegúrese de tener los hornos de hibridación para configurar la temperatura en el inicio del proceso.
Protocol
Discussion
Dependiendo de cuántas muestras se van a procesar, esto puede ser un procedimiento que consumen mucho tiempo debido a los dos pasos de la incubación de una hora, y los lavados repetidos y pasos de centrifugación. Es mejor plan de dos días para este procedimiento para dejar un montón de tiempo. Si hay problemas para conseguir el volumen de extracto final en el tubo de Amicon para reducir hasta 200-500μl durante la concentración de ADN y el lavado, trate de hacer más lavados de TE y centrifugaciones (repetir la te…
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos y el Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación (NSERC) de Canadá para apoyar los estudios en curso en las regiones de bajo nivel de oxígeno de las aguas oceánicas costeras y abiertas. JJW fue apoyado por becas de NSERC y DAW fue apoyado por becas de NSERC, Killam y la Fundación Centro TULA financiado por la diversidad microbiana y la evolución. SL fue apoyada por el Centro TULA financiado por la Fundación para la Diversidad microbiana y evolución.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | ||
| 15ml tubes | Sigma | CLS430791 | ||
| 5cc syringe | BD | 309603 | ||
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit | |
| Butanol | Fisher | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) | |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter | 368690 | ||
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter | 369003 | ||
| Cesium chloride | Sigma | C4036 | ||
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma | 25666-500ML | ||
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma | E1510-10ml | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma | E5134 | ||
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C | |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | |||
| Lysozyme | Sigma | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE | |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | 50 bp cut off | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | ||
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma | 77617-500ML | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| RNase A | Fisher | BP2539-100 | 10 μg/ml | |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L4509 | 20% SDS | |
| Sterivex filters | Fisher | SVG010RS | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| TE buffer, pH 8.0 | ||||
| Trizma® base | Sigma | T1503 | ||
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter | 343847 | ||
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman | 343775 | ||
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman | 348302 | ||
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter |
Riferimenti
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- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
