הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

Summary

בסרט זה אנו מציגים את<em> לשעבר vivo</em> דור והרחבת CD40 המופעל בתאים אנושיים B (CD40-B) מתאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC) על ידי גירוי עם ליגנד CD40 ו – interleukin-4.

Abstract

CD40 המופעל בתאי B (CD40-B תאים) זוהו כמקור חלופי חיסונית של גירוי התאים המציגים אנטיגנים (APC) עבור חיסוני סרטן ^1-3. לעומת תאים דנדריטים (DCS), APC מאופיין הטובה ביותר, תאים CD40-B יש מספר מאפיינים ביולוגיים טכני מובהק. בדומה DCs, תאים B להראות ביטוי מוגבר של MHC ושיתוף גירוי מולקולות (Fig.1b), מפגינים יכולת הנדידה חזק מצגת להציג ביעילות אנטיגן ותאי T, לאחר גירוי עם ליגנד interleukin-4 ו CD40 (CD40L). עם זאת, בניגוד DCs בוגר או בוגרת, CD40 בתאי B-לבטא את לימפה הצומת השלישיה ביות מלא המורכב CD62L, CCR7/CXCR4, ותפקוד ליקוציט אנטיגן-1 (LFA1, CD11a/CD18), הכרחי ביות הלימפה לאיברים משני (Fig.1a) ^3. תאים CD40-B יכול להיווצר ללא קשיים של כמויות קטנות מאוד של דם היקפיים אשר ניתן להרחבה נוספת במבחנה על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים סרטניים (> 10 ⁹ תאים לכל מטופל) מתורמים בריאים, כמו גם חולים (Fig.1c, ד) ^1,4.

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשיג מופעל במלואו CD40-B תאים PBMC האדם. מולקולות מרכזיות בתרבות התא CD40 ליגנד, interleukin-4 (IL-4) ציקלוספורין A (CSA), אשר מתחדש בכל יום מחזור 3-4 התרבות. לענין מעבדה CD40 גירוי מסופק על ידי תאים NIH/3T3 להביע רקומביננטי אנושי CD40 ליגנד (tCD40L NIH/3T3) ^5. כדי למנוע זיהום עם הלא transfected תאים, ביטוי של ליגנד CD40 האדם על transfectants יש להיבדק באופן קבוע (Fig.2).

לאחר 14 ימים CD40-B בתרביות תאים מורכבים יותר טהור 95% תאים B ו הרחבה של CD40-B תאים מעל 65 ימים ניתן לעתים קרובות ללא כל אובדן של ^{1 לתפקד, 4.} תאים CD40-B ביעילות לקחת, תהליך להציג אנטיגנים לתאי T ^6. הם לא רק naϊve הממשלה, אלא גם להרחיב את הזיכרון בתאי T ^7,8. CD40 המופעל בתאי B יכול לשמש כדי ללמוד B-cell, הפעלת התמיינות ותפקוד. יתר על כן, הם מייצגים כלי מבטיח עבור חיסון או טיפול מונע נגד גידולים ^9.

Protocol

פרוטוקול עבור הדור של CD40 המופעל בתאים אנושיים B מ PBMC מחולק לשני חלקים: חלק א 'מדגים את הכנת CD40 ליגנד להביע NIH/3T3 תאים, אשר ישמש צלחת הנכנס לתאים מזין. חלק ב 'מתאר את התרבות בפועל CD40-B. א הכנת תאים מזין (tCD40L NIH/3T3) <p class="jove_content" style=";text-a…

Materials

A. Preparation of Media:

Feeder cell wild type medium		Feeder cell selection medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
DMEM-Ham’s / F12		DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine	365 μg/mL	L-Glutamine	365 μg/mL
FBS	10 %	FBS	10 %
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		G-418	0.7 mg/mL

CD40-B washing medium		CD40-B culture medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
IMDM		IMDM
L-Glutamine	584 μg/mL	L-Glutamine	584 μg/mL
HEPES	25 mM	HEPES	25 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		rh Transferrin	50 μg/mL
		rh Insulin	5 μg/mL
		AB-Humanserum	10 %

B. Miscellaneous Reagents:

Reagent	Company	Order No
DMEM / Ham’s F12	PAA	Cat No: E15-813
IMDM	Invitrogen Gibco®	REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x)	PAA	Cat No H15-011
AB-Human Serum	Invitrogen	Cat No 34005100
holo-Transferrin human	Sigma	Cat No T0665
Insulin human	Sigma	Cat No I2643
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4	Immunotools	Cat No 11130045
Cyclosporin A	Novartis	Cat No NDC 0078-0109-01
FBS	LONZA	Cat No DE14-802C
HEPES Buffer	PAA	Cat No S11-001
G-418 Sulphate	PAA	Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x)	Invitrogen Gibco®	REF 15400-054

C. Miscellaneous Supplies:

Reagent	Company	Order No
Sterile pipette tips	Sarstedt
6-well plate	NUNC	Cat No 140675
50mL conical tube	BD Falcon™	Cat No 352070
Tissue culture flask	SARSTEDT	Cat No 83.1813.002