Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion
Summary
Bau eines Fosmid Bibliothek mit Umwelt-genomischer DNA aus der vertikalen Tiefe Kontinuum einer saisonal hypoxischen Fjord isoliert beschrieben. Der resultierende Klon-Bibliothek ist in 384-Well-Platten aufgenommen und archiviert für Downstream-Sequenzierung und funktionelle Screening durch die Anwendung eines automatisierten Kolonie Kommissioniersystem.
Abstract
Die überwiegende Mehrheit der Mikroben in der Natur bestehen derzeit noch unzugänglich traditionellen Anbaumethoden. Während des letzten Jahrzehnts, Kultur-unabhängigen Umweltgutachter genomische (<em> Dh</em> Metagenomische) Ansätze entstanden, so dass die Forscher diese Lücke Anbau durch die Erfassung der genetischen Inhalt der indigenen mikrobiellen Gemeinschaften direkt aus der Umwelt zu überbrücken. Zu diesem Zweck sind genomischen DNA-Bibliotheken unter Verwendung von Standardtechniken wenn auch kunstvolle Labor Klonierungstechniken. Hier beschreiben wir den Bau einer großen einfügen Umwelt genomische Fosmid Bibliothek mit DNA aus der vertikalen Tiefe Kontinuum einer saisonal hypoxischen Fjord abgeleitet. Dieses Protokoll wird direkt an eine Reihe von verbundenen Protokolle einschließlich der Küstengewässer Meerwasser Probenahme [1] verbunden, großvolumige Filtration von mikrobieller Biomasse [2] und ein DNA-Extraktion und Reinigung-Protokoll [3]. Zu Beginn ist von hoher Qualität genomischen DNA mit der Schaffung von 5-phosphorylierten stumpfen Enden Ende repariert. End-reparierte DNA ist Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE) für Größe Auswahl und Gel-Extraktion wird durchgeführt, um DNA-Fragmente zwischen 30 und 60 Tausend Basenpaaren (Kb) in der Länge wieder ausgesetzt. Größe ausgewählt DNA liegt abseits der PFGE Gelmatrix gereinigt und ligiert, um die Phosphatase-behandelten blunt-end Fosmid CopyControl Vektor pCC1 (EPICENTRE<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear Konkatemeren von pCC1 und Insert-DNA werden anschließend headfull verpackt in Phagenpartikel durch Lambda terminase, mit nachfolgender Infektion des Phagen-resistente<em> E. coli</em> Zellen. Erfolgreich transduzierten Klone auf LB-Agarplatten unter Antibiotika-Selektion erholt und archiviert in 384-Well-Platten-Format mit Hilfe eines automatisierten Kolonie Kommissionier-Roboter (Qpix2, GENETIX). Das aktuelle Protokoll speist sich aus verschiedenen Quellen, einschließlich der CopyControl Fosmid Bibliothek Production Kit von EPICENTRE und die veröffentlichten Arbeiten mehrerer Arbeitsgruppen [4-7]. Jeder Schritt wird mit Best-Practice im Auge präsentiert. Wann immer möglich, werden wir Feinheiten in der Ausführung Highlight die allgemeine Qualität und Effizienz der Bibliothek Produktion zu verbessern. Der gesamte Prozess der Fosmid Bibliothek Herstellung und automatisierte Kommissionierung Kolonie dauert mindestens 7-10 Tage, da es viele Inkubationsschritte enthalten sind. Allerdings gibt es mehrere Haltestellen möglich, die innerhalb des Protokolls genannt sind.
Protocol
Discussion
Eine Prozedur ist beschrieben, wie man am effizientesten erzeugt eine große einsetzen Fosmid Bibliothek mit genomischer DNA aus einer Küstengewässer Probe abgeleitet. Up-stream genomischen DNA-Extraktion ist in einem gesonderten Protokoll [3] beschrieben.
Als Fosmid-Bibliothek Produktion ist ein mehrstufiger Prozess-, Plan mindestens zwei vor drei Wochen in der Zeit für das gesamte Verfahren einschließlich aller vier vorgestellten Schritte. Die Extraktion von genomischer DNA ist der wic…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada für die Unterstützung laufender Studien auf niedrigem Sauerstoffgehalt Regionen der Küsten-und offenen Meer zu danken. MT und SL wurden von Stipendien von der Stiftung finanziert TULA Zentrum für Mikrobielle Vielfalt und Evolution (CMDE) unterstützt. MT erhielt Stipendium von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
Riferimenti
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
