대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작
Summary
계절 hypoxic 피요르드의 수직 깊이 연속으로부터 격리 환경 게놈 DNA와 fosmid 라이브러리의 구축이 설명되어 있습니다. 그 결과 클론 라이브러리는 384 잘 접시에 들어서 자동 식민지 따기 시스템의 응용 프로그램에서 스트림 시퀀싱 및 기능 검사를 위해 보관됩니다.
Abstract
자연 미생물의 대부분은 현재 전통적인 재배 방식에 액세스할 수 남아 있습니다. 지난 10 년간, 문화, 독립적인 환경 게놈 (<em> 예</em> metagenomic) 접근 방식은 연구자가 환경에서 직접 토착 미생물 커뮤니티의 유전 내용을 캡처하여 재배 격차를 다리 수 있도록, 부상했습니다. 이를 위해 게놈 DNA 라이브러리 좋을 실험실 복제 기법 불구하고 표준을 사용하여 제작하고 있습니다. 여기서 우리는 계절 hypoxic 피요르드의 수직 깊이 연속에서 파생된 DNA와 큰 삽입 환경 게놈 fosmid 라이브러리의 건설을 설명합니다. 이 프로토콜은 직접적으로 연안 해양 수질 샘플링 [1]을 포함한 연결 프로토콜 시리즈 연결된 미생물 바이오 매스의 대량 여과 [2]와 DNA 추출 및 정화 프로토콜 [3]. 다시 원점으로, 고품질의 게놈의 DNA는 5 phosphorylated 무딘 종료의 생성과 함께 최종 수리입니다. 최종 수리 DNA는 크기의 선택과 겔 추출이 30 60000 기본 쌍 (KB) 길이 사이의 DNA 조각을 복구 수행을위한 펄스 – 필드 겔 전기 영동 (PFGE)를 받게됩니다. 사이즈 선택 DNA는 PFGE 젤 매트릭스 멀리 정화 및 인산 가수 분해 효소 – 처리 무딘 엔드 fosmid CopyControl 벡터 pCC1 (EPICENTRE에 출혈도 잡았입니다<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). pCC1과 삽입 DNA의 선형 concatemers는 이후 파지 모성의 후속 감염, 람다 파지 terminase에 의해 입자로 포장 headfull 아르<em> E. 대장균</em> 세포. 성공적으로 transduced 클론은 항생제 선택에 따라 LB 한천 플레이트에 대한 회수 및 로봇을 따기 자동 콜로니 (Qpix2, GENETIX)를 사용하여 384 자 플레이트 형식으로 저장이됩니다. 현재 프로토콜은 EPICENTRE에서 CopyControl Fosmid 라이브러리 제작 키트 등 다양한 소스에서 그리는 여러 연구 그룹의 발표 작품 [4-7]. 각 단계는 마음에 모범 사례와 함께 제공됩니다. 우리 도서관 생산의 전반적인 품질과 효율성을 향상시키기 위해 실행 미묘을 강조 가능하다면. 포함된 여러 배양 단계가 같은 fosmid 라이브러리 제작 및 자동 식민지 따기의 전체 프로세스는 적어도 7~10일 걸립니다. 그러나, 프로토콜 내에서 설명하는 몇 가지 가능한 멈추는 지점이 있습니다.
Protocol
Discussion
절차는 가장 효율적으로 해안 물 샘플에서 파생된 게놈 DNA와 큰 삽입 fosmid 라이브러리를 생성하는 방법을 설명합니다. 업 – 스트림 게놈의 DNA 추출은 별도의 프로토콜 [3]에 설명되어 있습니다.
fosmid 라이브러리 생산 다단계 프로세스, 계획 네 명 모두 제공 단계를 포함하여 모든 절차에 시간에 최소한 2~3주 때문입니다. 게놈 DNA의 추출은 가장 중요한 단계와 단계를 추출한 게…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 해안과 열린 바다 바닷물의 낮은 산소 지역에 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금과 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. MT와 SL은 미생물 다양성과 진화 (CMDE)의 툴라 기초 투자 센터에서 장학금으로 지원했다. MT 또한 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에서 화목 지원을 받았습니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
Riferimenti
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
