Большой Вставить экологического производства геномной библиотеки
Summary
Строительство fosmid библиотека с экологическими геномной ДНК, выделенной из вертикального континуума глубины сезонно гипоксических фьорда описано. В результате клон библиотеки собирают в 384-луночных планшетах и архивируются для последующих последовательности и функционального скрининга путем применения автоматизированной системы сбора колонии.
Abstract
Подавляющее большинство микробов в природе в настоящее время остаются недоступными для традиционных методов культивирования. За последние десять лет, культуры, независимых экологических геномной (<em> Т.е.</em> Метагеномных) подходы появились, позволяя исследователям восполнить этот пробел путем культивирования захвата генетического содержания микробных сообществ коренных непосредственно из окружающей среды. С этой целью геномной библиотеки ДНК построены с использованием стандартных хотя и хитрые методы клонирования лаборатории. Здесь мы опишем строительство крупного вставить экологические геномной fosmid библиотека с ДНК происходит от вертикального континуума глубины сезонно гипоксических фьорда. Этот протокол напрямую связана с серией связанных протоколов, включая прибрежные морские отбора проб воды [1], большой объем фильтрации микробной биомассы [2] и выделения ДНК и очистки протокола [3]. Прежде всего, высокая геномной ДНК качество конечного восстановлены с помощью создания 5-фосфорилированных тупыми концами. Конечные отремонтировано ДНК подвергается пульсирующем поле гель-электрофореза (PFGE) для выбора размера и гель добыча осуществляется для восстановления фрагментов ДНК между 30 и 60 тыс. пар оснований (Kb) в длину. Размер выбранного ДНК очищается от матрицы геля PFGE и лигировали фосфатазы обработанных тупого конца fosmid CopyControl вектор pCC1 (ЭПИЦЕНТР<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Линейный concatemers из pCC1 и вставьте ДНК впоследствии headfull упакованы в фага лямбда частиц terminase, с последующим заражения фагоустойчивых<em> Е. палочки</em> Клеток. Успешно трансдуцированных клоны будут восстановлены на пластинах LB агар при выборе антибиотика и архивируются в 384-луночного формата пластины с использованием автоматизированных колонии сбор робота (Qpix2, GENETIX). Текущий протокол черпает из различных источников, включая CopyControl Библиотека Fosmid Производство Kit от ЭПИЦЕНТР и опубликованные работы нескольких исследовательских групп [4-7]. Каждый шаг представляется наилучшей практике в уме. По мере возможности мы выделяем тонкости в исполнении для повышения общего качества и эффективности библиотечного производства. Весь процесс производства fosmid библиотеки и автоматизированные сбор колония занимает не менее 7-10 дней, как Есть много шагов инкубации включены. Однако Есть несколько остановочных пунктов возможных, которые упомянуты в протоколе.
Protocol
Discussion
Процедура описана, как наиболее эффективно генерировать большие вставки fosmid библиотека с геномной ДНК, полученных из прибрежных пробы воды. Вверх по течению геномной ДНК добыча описана в отдельном протоколе [3].
Как fosmid-библиотека производство многоступенчатых процесс?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Канадский фонд инноваций, знаний британской Колумбии Фонд развития и Национального наукам и инженерным исследованиям Совета (NSERC) Канады за поддержку проводимых исследований на регионах с низким уровнем кислорода в прибрежных и открытых водах океана. М. Т. и С. были поддержаны стипендии ТУЛА основу финансируемого Центром микробного разнообразия и эволюции (CMDE). МТ также получили стипендии от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
Riferimenti
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
