Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca
Summary
Construcción de una biblioteca fosmid con el ADN genómico aislado del medio ambiente de la continuidad de profundidad vertical de un fiordo de la temporada hipóxica se describe. La biblioteca clon resultante se recoge en placas de 384 pocillos y se archivan para la secuenciación de aguas abajo y la detección funcional mediante la aplicación de un sistema de recogida automatizada de la colonia.
Abstract
La gran mayoría de los microbios en la naturaleza en la actualidad siguen siendo inaccesibles para los métodos de cultivo tradicionales. Durante la última década, la cultura independiente de la genómica ambiental (<em> Ie</em> Metagenómica) enfoques han surgido, lo que permite a los investigadores a cerrar esta brecha mediante la captura de cultivo el contenido genético de las comunidades indígenas microbiana directa del medio ambiente. Para este fin, las bibliotecas de ADN genómico se construyen usando estándares, aunque ingeniosa técnicas de laboratorio de clonación. A continuación se describe la construcción de una biblioteca genómica insertar grandes fosmid medio ambiente con el ADN derivados de la continuidad de profundidad vertical de un fiordo de la temporada de hipoxia. Este protocolo está directamente relacionado con una serie de protocolos de conexión incluyendo el muestreo de las aguas costeras marinas [1], la filtración de grandes volúmenes de biomasa microbiana [2] y la extracción del ADN y el protocolo de purificación [3]. Al principio, el ADN genómico de alta calidad final reparado con la creación de 5-fosforilados extremos romos. Final de reparar el ADN se somete a electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) para la selección del tamaño y la extracción de gel se realiza para recuperar los fragmentos de ADN entre 30 y 60 mil pares de bases (Kb) de longitud. ADN tamaño seleccionado se purifica lejos de la matriz de gel PFGE y se ligó con la fosfatasa tratados con extremo romo fosmid CopyControl vector PCC1 (EPICENTRO<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Concatemers lineal de PCC1 y el ADN se inserta posteriormente headfull empaquetados en partículas de fago lambda por terminasa, con posterior infección de resistentes a los fagos<em> E. coli</em> Células. Clones con éxito transducidas se recuperan en placas de agar LB con los antibióticos de selección y se archivan en formato de 384 pocillos placa utilizando una colonia automatizado recoger robot (Qpix2, GENETIX). El protocolo ha sido elaborada a partir de varias fuentes, incluyendo el kit de Producción CopyControl Fosmid Biblioteca de EPICENTRO y los trabajos publicados por varios grupos de investigación [4-7]. Cada paso se presenta con las mejores prácticas en la mente. Siempre que sea posible se destacan las sutilezas de la ejecución para mejorar la calidad y la eficiencia general de la producción de la biblioteca. Todo el proceso de producción de la biblioteca y recoger fosmid colonia automatizado toma por lo menos 70-10 días, ya que hay muchos pasos de incubación incluidos. Sin embargo, hay varios posibles puntos de parada que se mencionan en el protocolo.
Protocol
Discussion
El procedimiento se describe cómo generar más eficiente una biblioteca fosmid gran inserción con el ADN genómico derivado de una muestra de las aguas costeras. Aguas arriba de extracción de ADN genómico se describe en un protocolo separado [3].
A medida que la producción fosmid-biblioteca es un proceso de varios pasos, el plan de al menos dos a tres semanas de tiempo para el procedimiento completo, incluyendo todos los pasos cuatro que se presentan. La extracción de ADN genómico es …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos y el Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación (NSERC) de Canadá para apoyar los estudios en curso en las regiones de bajo nivel de oxígeno de las aguas oceánicas costeras y abiertas. MT SL y con el apoyo de becas del Centro de TULA financiado por la Fundación para la Diversidad Microbiana y Evolución (CMDE). MT también recibió el apoyo de becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
Riferimenti
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
