Fare Diploide Zebrafish Gynogenetic di Pressure presto
Summary
Questo è un metodo per la generazione di embrioni di zebrafish gynogenetic diploide (embrioni il cui unico contributo genetico proviene dalla madre), bloccando la seconda divisione meiotica subito dopo la fecondazione con luce ultravioletta-inattivato sperma. Embrioni EP non sono completamente omozigoti per ricombinazione durante la prima divisione meiotica, tuttavia sono omozigoti a tutti i loci che non sono stati separati dalle loro centromero dalla ricombinazione.
Abstract
Eterozigosi negli eucarioti diploidi spesso rende studi genetici ingombrante. I metodi che producono prole vitale diploide omozigote direttamente dalle femmine eterozigoti permettono F1 femmine mutagenizzate di essere proiettati direttamente per le mutazioni deleterie in uno schermo accelerato in avanti genetica. Streisinger et al.<sup> 1,2</sup> Descritti metodi per rendere gynogenetic (omozigoti) zebrafish diploide attivando uova di pesce zebra con luce ultravioletta-inattivato sperma e la prevenzione o il meiotica seconda o prima divisione cellulare zigotico con trattamenti fisici (calore o pressione) che microtubuli deploymerize. La "pressione precoce" (EP) blocca il metodo meiosi II, che si verifica poco dopo la fecondazione. Il metodo PE produce un'alta percentuale di embrioni vitali che possono sviluppare per adulti fertili di entrambi i sessi. Il metodo genera embrioni che sono omozigoti a tutti i loci ad eccezione di quelli che sono stati separati dai loro centromero dalla ricombinazione durante la meiosi I. mutazione omozigote vengono rilevati in frizioni tra il Parlamento europeo al 50% per i loci centromerica e meno dell'1% per i loci telomerica. Questo metodo è riprodotto testualmente dal libro Zebrafish<sup> 3</sup>.
Protocol
Discussion
E 'importante assicurarsi che gli embrioni prodotti con questo metodo sono diploidi gynogenetic vero. Come controlli, generano una frizione delle uova diploidi normali (tenendo da parte alcune delle spermatozoi senza UV-inattivazione) e una serie di embrioni aploidi (tenendo da parte una frizione delle uova fecondate con gli spermatozoi UV senza passare per la procedura di PE). A 1 giorno dopo la fecondazione degli embrioni aploidi hanno un asse corto del corpo, il cervello e la morfologia irregolare somite. Haploid…
Acknowledgements
Metodi per la fecondazione in vitro e diploidi gynogenetic sono stati sviluppati per zebrafish da Charline Walker nel laboratorio di Giorgio Streisinger presso l'Università dell'Oregon negli anni 1970 e 1980. Il metodo descritto qui è invariato rispetto a protocolli Charline, che sono disponibili per intero nel Libro Zebrafish 3.
Metodi per la fecondazione in vitro e diploidi gynogenetic sono stati sviluppati per zebrafish da Charline Walker nel laboratorio di Giorgio Streisinger presso l'Università dell'Oregon negli anni 1970 e 1980. Il metodo descritto qui è invariato rispetto a protocolli Charline, che sono disponibili per intero nel Libro Zebrafish 3.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine | Sigma | |||
| Watch glass | ||||
| French Press | ||||
| Pressure cylinder | ||||
| Instant ocean | ||||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | |||
| UV cross-linker | ||||
| microcapillaries |
Riferimenti
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetica. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetica. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetica. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
