Göra Zebrafish Gynogenetic diploida i början av Pressure
Summary
Detta är en metod för att generera gynogenetic embryon diploida sebrafisk (embryon vars enda genetiska bidrag kommer från mamman) genom att blockera den andra meiotiska divisionen omedelbart efter befruktningen med ultraviolett ljus-inaktiverat spermier. EP embryon är inte helt homozygot på grund av rekombination under första meiotiska divisionen, men de är homozygota alls loci som inte har skilts från sina centromer genom rekombination.
Abstract
Heterozygositet i diploid eukaryoter gör ofta genetiska studier besvärligt. Metoder som ger livskraftiga homozygot diploida avkomma direkt från heterozygota honor gör F1 mutagenized kvinnor att vara skärmade direkt skadliga mutationer i en snabbare framåt genetiska skärmen. Streisinger et al.<sup> 1,2</sup> Beskrivna metoder för att göra gynogenetic (homozygot) diploid zebrafisk genom att aktivera zebrafisk ägg med ultraviolett ljus-inaktiverat spermier och förhindra både det andra meiotiska eller första zygotic celldelningen med hjälp av fysiska behandlingar (värme eller tryck) som deploymerize mikrotubuli. Den "tidiga press" (EP)-metoden blockerar meios II, som inträffar strax efter befruktningen. Europaparlamentet metoden ger en hög andel av livskraftiga embryon som kan utvecklas till fertila vuxna av båda könen. Metoden genererar embryon som är homozygot alls loci utom de som var separerade från sina centromer genom rekombination under meios I. Homozygot mutationer upptäckts i EP kopplingar till mellan 50% för centromeric lokus och mindre än 1% för telomeric loci. Denna metod återges ordagrant från Zebrafish Bok<sup> 3</sup>.
Protocol
Discussion
Det är viktigt att se till att embryon produceras av denna metod är sant gynogenetic diploider. Som kontroller generera en koppling av normala diploida ägg (genom att hålla undan en del av spermierna utan UV-inaktivering) och en klunga haploida embryon (genom att hålla undan en hög med ägg befruktas med UV spermier utan att gå via Europaparlamentets förfarande). Vid en befruktning dag efter haploida embryon har en kort kropp axel, oregelbundna hjärnan och somit morfologi. Haploids inte är livskraftiga efter 2…
Acknowledgements
Metoder för provrörsbefruktning och diploider gynogenetic utvecklades för zebrafisk av Charline Walker i George Streisinger labb vid University of Oregon i 1970-talet och 1980-talet. Metoden som beskrivs här är oförändrat jämfört med Charline s protokoll som finns tillgängliga i sin helhet i Zebrafish Book 3.
Metoder för provrörsbefruktning och diploider gynogenetic utvecklades för zebrafisk av Charline Walker i George Streisinger labb vid University of Oregon i 1970-talet och 1980-talet. Metoden som beskrivs här är oförändrat jämfört med Charline s protokoll som finns tillgängliga i sin helhet i Zebrafish Book 3.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine | Sigma | |||
| Watch glass | ||||
| French Press | ||||
| Pressure cylinder | ||||
| Instant ocean | ||||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | |||
| UV cross-linker | ||||
| microcapillaries |
Riferimenti
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetica. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetica. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetica. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
