凝集素结合POROS珠被雇用的高效液相色谱法。糖肽类标准担任阳性和阴性对照。 MARS的14枯竭,胰蛋白酶消化人体血浆层析和流过(FT)和约束分数ESI-LC-MS/MS分析收集。糖肽的富集在绑定的分数相比,FT。
聚糖是一类重要的翻译后修饰。通常分泌和细胞外分子中,糖链结构的细胞信号的内部状态。聚糖对肿瘤细胞往往有丰富的唾液酸和岩藻糖基团。我们建议,旨在早期疾病诊断的生物标志物开发利用这些癌症相关聚糖变种。因此,我们开发了质谱为基础的工作流程,采用色谱凝集素,特定的糖链结构的蛋白质结合形成的亲和力矩阵。凝集素接骨木黑(SNA)和Aleuria aurantia(AAL),结合唾液酸和岩藻糖,分别,共价键耦合POROS珠(美国应用生物系统公司),并包装成高压液相色谱(HPLC)的PEEK列。简单地说,等离子消耗使用多重亲和去除系统(MARS – 14;安捷伦)的14个最丰富的蛋白质。贫血浆胰蛋白酶消化成流过约束分数和SNA或AAL高效液相色谱法分隔。的分数均与PNGaseF删除N -连接聚糖,和上一个QSTAR精英的LC-MS/MS分析。使用Mascot软件对数据进行分析。实验设计包括积极控制,fucosylated和唾液酸人乳铁蛋白糖肽和阴性对照组高甘露糖肽酿酒酵母,用于监测特异性的凝集素捕获。这个工作流程的主要功能包括格式的高效液相色谱法,deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr图案的捕获和PNGaseF处理的糖肽的积极识别和使用糖蛋白标准质量评估所得的重复性。协议优化还包括确定适当比例的起始原料,柱容量,找出最有效的捕获和洗脱缓冲液,并监测PNGaseF治疗,以确保充分deglycosylation。未来的方向,包括使用此工作流程执行从乳腺癌患者的血浆和控制个人质谱为基础的发现实验的。
该协议提供了一种快速分离鉴定糖肽在聚糖特有的方式方法。作为广泛的范围内,特别是在发展和发病机制的有机体,糖基化变化,这种技术可能会适用于解决一个问题的多种。特别是,我们正在使用的方法,选择性地丰富糖肽已作为第一步对生物标志物发现与癌症相关的抗原表位修改。
这项工作是由癌症的主动性,5U24CA126477 – 04的临床蛋白质组学技术支持。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Human plasma | We make this in house | |||
Human lactoferrin | Sigma | L0520 | Trypsin-digest before use | |
Yeast invertase | Sigma | I0408 | Trypsin-digest before use | |
Oass HLB SPE cartridges | Waters | WAT094225 | 1 cc volume | |
ZipTip pipet tips | Fisher | ZTC1 8M0 96 | Millipore, C18 for 10 ml pipette | |
Tris | Fisher | BP154-1 | 99% | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141 | 99% | |
Calcium chloride | Sigma | C4901 | 96% | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | 98% | |
Acetic acid | Sigma | 242853 | 99.7% | |
pH indicator paper | Fisher | M95903 | Range 0-14 | |
Acetonitrile | Fisher | A998 | 99.9% | |
Formic acid | Pierce | 28905 | 99% | |
Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 14190-136 | Without calcium and magnesium | |
Sodium azide | Sigma | 71289 | 99.5% | |
PNGase F | New England Biolabs | P0705L | Glycerol-free | |
Vacuum-filter flasks | Fisher | SCGVU05RE | 0.2 mm pores | |
POROS-AL beads | Applied Biosystems | 1-6028-02 | ||
Aleuria aurantia lectin | Vector Laboratories | L-1390 | ||
Sambucus nigra agglutinin | Vector Laboratories | L-1300 | ||
Sodium cyanoborohydride | Sigma | 296945 | 5.0 M solution |